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医学论文:MicroRNA-21抑制剂联合伊马替尼对慢性粒系白血病K562细胞增殖的作用

发表时间:2012/12/21 15:45:37

医学论文:MicroRNA-21抑制剂联合伊马替尼对慢性粒系白血病K562细胞增殖的作用
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赵广富1,朱贵华1,苏林2
(1.连云港市第二人民医院,江苏连云港 222023;2.中国医学科学院_协和医学院基础医学研究所,_100005)
摘要:
目的 探讨microRNA-21基因拮抗联合酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的增殖及周期的调控作用。
方法 在293TN细胞中包装并收获可以抑制内源microRNA-21表达的重组慢病毒颗粒,进行病毒滴度测定后,感染K562,经流式分选得到GFP阳性的K562细胞株。Northern blot证实感染后microRNA-21的表达,MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期。
结果 Northern blot证实K562细胞中microRNA-21的表达水平与正常人外周血细胞相比明显升高。抑制microRNA-21表达的K562细胞株生长速度明显减慢,细胞周期运行也受到阻滞;伊马替尼作用于microRNA-21表达抑制的K562细胞后,细胞增殖与伊马替尼单独作用的
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cle was measured by flow cytometry.
Results MicorRNA-21 was significantly up-regulated in K562 cells compared with peripheral blood cells from normal. Inhibition of micorRNA-21 in K562 cells decreased cell proliferation and cell cycle progression. The growth of K562 cells tranduced with Lenti-miR-21 was markedly inhibited after imatinib treatment. Moreover, The percentage of cells at G0/G1 phase greatly increased after transduction with Lenti-miR-21 to K562 combined with imatini.
Conclusion The inhibition of micorRNA-21 in combination with imatinib has a synergistic effect on the proliferation and cell cycle progression of K562 cells.
Key words:microRNA-21;imatinib;k562 ;
micorRNA(小RNA)是近年来新发现的一类调节分子,它通常通过与靶mRNA分子互补结合使mRNA的翻译受阻或使靶mRNA降解而抑制其表达[1]。microRNA所介导的转录后调控已经成为公认的真核生物基因表达调控网络的重要组成结构,并与转录因子、表观遗传调控因子等协同作用共同完成复杂生命活动的调节。已有的研究结果证明microRNA的作用深入到了生命活动的各个方面,包括组织器官发育、细胞增殖和凋亡、能量代谢、细胞迁移和病毒感染等等[2,3]。而且越来越多的证据表明许多microRNA参与了肿瘤的发生和发展,相应地,在体外和动物体内也有实验证实通过外源干预microRNA的表达可以达到抑制肿瘤细胞生长的目的[2-4]。
最近,有报道指出microRNA-21在慢性髓系白血病(CML)患者中表达显著上升,使用体外合成的microRNA-21抑制剂转染人慢性髓系白血病细胞系K562,能够抑制细胞的增殖和迁移,说明拮抗microRNA-21在CML治疗中的潜在价值[5]。伊马替尼是传统的CML治疗药物,但也存在耐药复发的问题,因此,寻找新的CML治疗靶点,并实验联合用药对于极大程度上缓解CML具有重要意义。本研究在了解microRNA-21参与CML发生发展的分子机制基础上,实验microRNA-21抑制剂联合伊马替尼对髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响,为microRNA应用于白血病的临床治疗,以及将microRNA与传统化疗药物联合使用提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1主要药物及试剂
伊马替尼(瑞典Novartis公司赠送),用三蒸水配制成1mmol/L溶液,过滤除菌。CML急变期细胞株K562由中国医学科学院细胞中心保存。DMEM培养基(美国Gibco公司),无支原体胎牛血清(杭州四季青生物制品公司),RNA提取试剂盒Trizol(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒(美国Promega公司),PCR试剂盒(_博迈德公司),pcMIRNA慢病毒表达质粒(美国SBI公司),转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)。
1.1.2主要仪器
PTC100型PCR仪由美国MJ Research股份有限公司制造,DYCZ-26B电泳仪由_沃德生物医学仪器公司制造,FACSAria流式细胞仪由美国BD公司制造。

1.2 方法
1.2.1细胞培养及外周血单个核细胞的获得
人慢性髓系白血病细胞系K562由本室保存,将细胞置于含10%胎牛血清、1*105IU/L青霉素及1*105IU/L链霉素的DMEM培养液中,于37℃、5% CO2培养箱中常规培养。
将所采集的新鲜正常人外周血以含2mmol/L EDTA的1*PBS按照1:4体积进行稀释,然后用滴管反复吹打混匀。在20*150mm灭菌试管底部加入4ml 淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml)。将稀释好的外周血用滴管轻轻铺于分离液上,20°C,400g水平离心30~40min。小心地吸取中间相(含单个核细胞)到一个新的50ml离心管中。管中再加入含2 mM EDTA的1*PBS, ……(未完,全文共9652字,当前仅显示2636字,请阅读下面提示信息。收藏《医学论文:MicroRNA-21抑制剂联合伊马替尼对慢性粒系白血病K562细胞增殖的作用》
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