毕业开题报告：p53与hssb1蛋白的分离纯化与相互作用的研究

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院　　　　　　　　 　专业班级：2008级生物工程一班　

课题名称 p53与hssb1蛋白的分离纯化与相互作用的研究

1、本课题的的研究目的和意义：
目的：通过分子克隆的方法分别表达带有sumo标签的p53和hssb1（人类DNA单链结合蛋白）蛋白，经过镍亲和柱，FPLC(快速蛋白液相色谱)中的分子筛和离子交换层析分离纯化目的蛋白，将分离的两种蛋白等量混合分别用ITC（等温滴定量热法），和分子筛，通过观察出峰情况分析两种蛋白的相互作用。
意义：Hssb1调节多种DNA复制，转录和修复，近期发现它对妊娠期胎儿呼吸以及骨骼生长有着重要作用，也有发现Hssb1与抑癌基因P53有相互作用，这对进一步研究癌症提供了线索，本课题主要是运用分子克隆以及蛋白质分离纯化的技术手段，提纯Hssb1与P53蛋白，并运用几种方法分析两种蛋白的相互作用，最终从机理上理解两种蛋白的作用原理，为治疗癌症提供新的思路。
2、文献综述（国内外研究情况及其发展）：
抑癌基因p53在维持基因稳定和阻止肿瘤发生的过程中发
……（新文秘网https://www.wm114.cn省略800字，正式会员可完整阅读）……　
21基因表达的关键事件。
目前，对p53与hssb1相互作用的机理了解的还不够清楚，本课题旨在分离纯化两种蛋白，通过分子筛和ITC研究两种蛋白有无相互作用及相互作用的强度，课题后续工作为结晶分离出来的蛋白，通过核磁共振和*射线技术研究两种蛋白相互作用的机理，为研究肿瘤的机理和肿瘤治疗的机理提供新的思路。

3、本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
研究内容：
3.1、制备出带有标签的能够表达目的蛋白的重组质粒；
3.2、目的蛋白的分离纯化；
3.3、目的蛋白的相互作用分析。
成果形式：
提交本科学士论文。
4、拟解决的关键问题：
通过反复实验优化每一步的实验条件，分离纯化出大量的目的蛋白，分析两种蛋白的有无相互作用及作用机理。
5、研究思路、方法和步骤：
5.1重组p53，hssb1基因的制备及转化表达
1）分别设计引物以两种基因的全长基因为模版PCR扩增两种基因的_片段；
2）选择合适的载体分别利用限制性内切酶酶切特异性片段并将目的基因连入载体并转化入top 10菌株（目的基因应带有sumo或GST融合标签），涂板，挑克隆后小摇扩增质粒；
3）提取质粒，分别用PCR和双酶切的方法验证质粒正确性，正确的质粒送测序，检查有无突变；
4）将质粒转化进入表达菌株，通过小摇，大摇，诱导，表达目的蛋白。
5.2 目的蛋白的分离纯化
1）收集菌体，用裂解液悬浮菌体，超声或高压破碎菌体，高速离心收集上清；
2）亲和层析，将上清与ni—beads混合4度binding两个小时，分别用低浓度咪唑清洗和高浓度咪唑洗脱；
3）FPLC(快速蛋白液相色谱)进行分子筛和离子交换层析分离春花目的蛋白，并跑胶验证。
5.3 目的蛋白相互作用的研究
1）利用ITC测定两种蛋白的相互作用，得到Km值；
2）两种蛋白等量混合，跑分子筛，分析出峰情况分析相互作用；
3) 蛋白结晶，通过核磁共振和*射线研究两种蛋白相互作用机理。
6、本课题的进度安排：
2013.3.1—2013.3.15 成功制备出表达目的蛋白的重组质粒；
2013.3.16—2013.4.15 成功分离纯化目的蛋白，并完成相互作用的分析；
2013.4.16—2013.5.15 重复实验，完善蛋白纯化的最佳条件；
2013.4.1—2013.6.1 阅读大量相关文献，并撰写论文。
7、参考文献：
[1] Levine AJ, Hu W, Feng Z. The P53 pathway: what questions remain to be e*plored? Cell Death Differ 2006; 13:1027-1036.
[2] Vousden KH, Prives C. Blinded by the light: The growing comple*ity of p53. Cell 2009; 137:413-431.
[3] Vousden KH, Lu *. Live or let die: the cell’s response to p53. Nat Rev Cancer 2002; 2:594-604.
[4] Riley T, Sontag E, Chen P, Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9:402-412.
[5] Bode AM, Dong Z. Post-translational modification of p53 in tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2004; 4:793-805.
[6] Dai C, Gu W. p53 post-translational modification: deregulated in tumorigenesis. Trends Mol Med 2010; 16:528-536.
[7] Brooks CL, Gu W. ……（未完，全文共4448字，当前仅显示2247字，请阅读下面提示信息。收藏《毕业开题报告：p53与hssb1蛋白的分离纯化与相互作用的研究》）