毕业设计开题：米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息学分析

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院　　　　　　　　　　　　　专业班级：08生物工程1班

课题名称 米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息学分析

1、本课题的的研究目的和意义：
研究目的：
1.本课题通过PCR扩增得到磷酸果糖激酶基因，构建重组质粒并转化到大肠杆菌中以得到磷酸果糖激酶的阳性克隆，为后续构建表达载体，蛋白活性表达奠定基础。
2.对米曲霉磷酸果糖激酶进行酶学分析，二级、三级结构预测，为米曲霉的糖酵解代谢调控奠定基础。为阐述米曲霉的中心碳代谢流提供依据。

研究意义：
糖酵解途径（EMP）是糖代谢的重要生理途径，其主要作用是在有氧条件下为生物体迅速提供能量，其中磷酸果糖激酶是糖酵解途径的关键限速酶。米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及酶学分析能更阐述米曲霉糖酵解途径，为米曲霉的相关代谢调控奠定基础。
2、 文献综述（国内外研究情况及其发展）：
米曲霉（Aspergillus oryzae ） 是一种好气性真菌，属于半知菌亚门、曲霉属，菌丝一般呈黄绿色
……（新文秘网https://www.wm114.cn省略721字，正式会员可完整阅读）……　
C5.7.1.11）是糖酵解EMP途径中的限速酶，负责催化6-磷酸果糖为1，6-二磷酸果糖：ATP + 6-磷酸果糖 → ADP + 1，6-二磷酸果糖，其N 末端为结合ATP 的结构单元，C 末端为结合6-磷酸果糖的结构单元和磷酸烯醇式丙酮酸反馈调节时结合的部分[12]。目前磷酸果糖激酶的研究主要集中在原核生物中，如韩蓓等进行了球形芽胞杆菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表达及基本生物活性[11]，周传奇等进行了腾冲嗜热厌氧菌6-磷酸果糖激酶的克隆[12],表达及其生物活性，周雍进进行了利迪链霉菌初级代谢关键基因的克隆与功能分析[13]，但是丝状真菌报道较少。米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆和酶学分析不仅能为后期进行蛋白酶的表达创造条件，更清楚地阐述米曲霉糖酵解途径，为米曲霉的相关代谢调控奠定基础。
3、 本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
主要的研究内容：
本课题通过PCR扩增得到磷酸果糖激酶基因的克隆，构建pMD19-T重组质粒并转化到大肠杆菌中,利用蓝白斑筛选得到磷酸果糖激酶的阳性转化子，利用菌液PCR、凝胶电泳和酶切验证克隆产物，并对克隆的基因进行基因测序，最后通过生物信息学手段对该基因编码的酶进行酶学分析、高级结构预测和进化分析。

成果形式：
本课题致力于米曲霉磷酸果糖激酶的克隆，主要的成果展示为电泳图谱展示，其中包含了一些实验测的的数据以及和国内研究情况的对比分析，并通过生物信息学对该基因编码的酶的高级结构进行预测和酶学分析，企图从糖酵解途径中关键酶出发，为阐述米曲霉糖酵解途径和代谢调控奠定基础。最终的成果主要以实验数据、电泳图谱和生物信息学分析预测来组合展示，已提供直接的学习、研究材料，以备今后做进一步的探究。

4、拟解决的关键问题：
不同基因具有各自的特异性，需要摸索磷酸果糖激酶的克隆条件，获得PCR产物，并进行有效的连接和转化。

目前课题研究存在的主要困难
由于米曲霉磷酸果糖激酶基因片段较长（2469bp），体外扩增较困难，需要对其体外扩增条件进行探究；另外长片段在连接和转化时也会遇到一定的困难。在挑选阳性克隆子时实验量较大。
5、研究思路、方法和步骤：

研究思路和步骤：
1、通过NCBI和DOGAN等数据库获得米曲霉果糖激酶基因序列，设计引物并合成，
2、提取米曲霉全基因组利用设计的引物进行PCR，提纯产物，
3、构建重组质粒并转化大肠杆菌，
4、筛选阳性克隆并验证产物。
5、对克隆后的基因序列进行生物信息学分析

主要涉及的研究方法：
1、本课题中，经过对相关的文献阅读和一定的实验比较，建立了米曲霉已糖激酶克隆的实际操作体系；
2、本课题中利用primer5.0设计PCR引物，利用PCR产物提取和凝胶提取两种方法提纯产物；
3、本课题中利用蓝白斑法筛选阳性克隆子，利用菌液PCR和凝胶电泳验证产物；
4、利用生物信息学相关软件对该基因及酶进行分析。

6、本课题的进度安排：

2012.2.15-2012.3.1： 查找文献，查找基因序列并设计引物
2012.3.2-2012.3.15： 探索PCR条件，构建重组质粒，转化大肠杆菌；
2012.3.16-2012.4.15：筛选阳性克隆子并验证，及生物信息学分析；
2012.4.16-2012.4.30：对研究结果进行验证性复合实验，以保证实验的结论准确性；
2012.5.1-2012.5.20： 写论文，准备答辩；

7、参考文献：
[1] 赵龙飞,徐亚军.米曲霉的应用研究进展[J].中国酿造,2006,(3)
[2] 王海娟,苏玉春,吴铭等.米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J].生物技术通讯,2010, ……（未完，全文共4006字，当前仅显示2023字，请阅读下面提示信息。收藏《毕业设计开题：米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息学分析》）