论文：青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株的构建及其防效评价模型分析

青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株的构建及其防效评价模型分析

郑雪芳1,2,刘波2(,林乃铨1(,朱育菁2,车建美2 (1_农林大学植物保护学院 福州 350002; 2_省农业科学院农业生物资源研究所 福州 350003)

摘要:
利用青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)无致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的应用潜力.作者通过分离筛选自然弱毒株、60Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变,共构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体55株.其中,从番茄青枯发病植株分离到3株、从60Co辐射诱变获得12株、从EZ-Tn5插入诱变获得40株.经盆栽番茄苗致病性检测,15d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌.进一步对番茄青枯病的防治试验表明,从番茄青枯病发病田块分离的无致病力突变株突变菌株FJAT-1458的防治效果最好,防效达100%.该菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和茎部,定殖数量均表现为"先增后减"的趋势,并且接种浓度越大、苗龄越小,定殖数量越大.从构建的防效模型可以看出,不同接种浓度条件下,植株发病率随时间变化符合的回归方程不同,相关系数R值也不同,接种浓度越大,R值越小.本研究获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT1458对番茄青枯病具有很好的防病效果.
关键词:番茄青枯病;青枯雷尔氏菌;无致病力突变株突变菌株;定殖;生物防治

Construction of avirulent mutants of Ralstonia solanacearum against tomato bacterial wilt disease and analysis of its control efficacy Zheng *uefang1,2, Liu Bo2, Lin Neiquan1, Zhang Wenzhou2, Zhu Yujing2, Lin Kangmei2, Che Jianmei2 (1College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2Agricultural Bio-Resources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China) Abstract: Avirulent Ralstonia solanacearum has a strong potential function in control tomato bacterial wilt disease. This study constructed avir
……（新文秘网https://www.wm114.cn省略1869字，正式会员可完整阅读）……　
wilt; Ralstonia solanacearum; avriulent mutant; colonization; biocontrol

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)通常引起番茄青枯病[1-3],由于该菌在土壤中存活时间长、传播快,尚未得到有效防治[4,5].青枯雷尔氏菌存在致病力分化,其弱/无致病力菌株进入植株,能在选择的环境或生态系统中存活、定植,对寄主不致病,不对寄主起系统毒性和免疫敏感性,能较长时期存于寄主组织,利用生态位竞争和营养竞争阻止或延迟致病菌的侵入,从而防止或延迟植株发病[6,7].因此,利用青枯雷尔氏菌的弱/无致病力菌株防治作物青枯病具有一定生防潜力.许多研究表明,青枯雷尔氏菌无致病力菌株能在一定程度上控制青枯病的发展.杨宇红等(2008),利用基因工程法获得的无致病力hrp-突变体防治茄科蔬菜青枯病罗宽等(1983)用60Co辐射和紫外诱变获得青枯雷尔氏菌无致病力突变株防治番茄青枯病,取,取得了一定良好的防病效果[8];陈庆河等(2003)利用紫外诱变法获得青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株处理番茄,发现了番茄对青枯病原抗性,且无致病力突变菌株可在番茄体内定殖和繁殖[9];董春等(1999)用自发突变的无致病力产细菌素菌株防治番茄青枯病取得一定的防治效果[10];Trigalet和Demery(1986)采用转座子Tn5插入诱变均获得青枯雷尔氏菌无致病力突变株,对番茄青枯病表现出良好的防效[11];Frey等(1993)通过对青枯致病菌的致病基因簇中某些片断缺失的方法产生无致病突变体,在温室内对番茄青枯病具有较好此外,刘波等[7]、肖田等[10]、Trigalet和Demery[11]及Frey等[12]分别通过生防菌致弱、自然筛选、转座子Tn5插入诱变、基因工程等途径获得青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株防治青枯病,均取得较好的防治效果.的防治效果[12].尽管前人在青枯雷尔氏菌无致病力突变株研究上做过一些研究,但是目前,构建青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株的筛选模型、寄主体内的定殖模型、对青枯病防效评价模型等研究未见报道. 本研究目的是通过构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,从中筛选出防效好、性状稳定的青枯雷尔氏菌无致病力突变株用于防治番茄青枯病.本研究综合采用分离筛选自然弱毒株、60Co辐射诱变致弱和EZ-Tn5插入诱变致弱来构建青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株,从中筛选到一株出防效防效最好、性状稳定的菌株,研究该菌株的定殖的特性,构建其对番茄青枯病防效评价模型,为番茄青枯病的有效控制奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 供试材料 致病性菌株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株FJAT91分离自番茄青枯病株,由_省农业科学院农业生物资源研究所菌种库收集并保存.供试的番茄品种为金石王1号,购自厦门如意集团开发有限公司.采用培养基TTC培养青枯雷尔氏菌[1313].转座子试剂盒EZ-Tn5? Insertion Kit 购自美国EPICENTR公司;Biospin 细菌基因组DNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶PstⅠ、T4连接酶购自美国Promega公司;卡那霉素(Km)购自美国Sigma公司.青枯雷尔氏菌特异性检测引物[14]:pehA#3: 5-CAGCAGAACCC GCGCCTGATCCAG-3,pehA#6: 5-ATCGGACT TGATGCG CAGGCCGTT-3由上海博尚有限公司合成;3000bp Marker购自上海英竣生物技术公司.

1.2 试验方法

1.2.1青枯雷尔菌无致病力突变株突变菌株的构建 (1)青枯雷尔氏菌自然弱毒株的分离 从_建瓯番茄青枯病发病田块采集不同发病级别的植株,进行病原菌的分离.分具体分离方法参照刘波方等[15]的方法法如下.:各样本冲洗干净后吸去水分,称取10 g,经严格的表面消毒后,研磨成匀浆,用无菌水进行系列梯度稀释,涂布于TTC平板上,30 ℃,培养48 h后,观察菌落的形态. (2)青枯雷尔氏菌转座子EZ-Tn5? 插入致弱突变株突变菌株的构建 以致病性青枯雷尔氏菌FJAT91作为出发菌株,将其活化于TSB平板上,挑取单菌落接种于TSB液体培养基中,170 r/min,30 ℃振荡培养过夜,按照1%接种比例接入200 mL新鲜的10%TSB培养基中,振荡培养至对数生长中期,冰浴30 min,4 ℃,6 500 r/min离心15 min,去上清,无菌水漂洗4次,沉淀用1 mL无菌水悬浮.取1 μL Tn5 Transposomes与100 μL的感受态细胞混合,电击条件为2.5 kv,25 μF和400 Ω,电击结束后,迅速加入900 μL10%TSB培养基,100 r/min,30 ℃培养后,涂布于含有50 μg/mL Km的10%TSB培养基上,30 ℃,培养48 h,观察菌落形态,根据菌落形态(无流动性,中间为暗红色,白边窄,表面干燥)挑取青枯雷尔菌无致病力突变株突变菌株,经纯化培养后,以终浓度为20%的甘油于?80 ℃保存. (3)青枯雷尔氏菌60Co辐射致弱突变株突变菌株的构建 青枯雷尔氏菌FJAT91为出发菌株,菌株经TTC平板活化后,接种于SPA液体培养基,170 r/min,30 ℃培养24 h后,8 000 r/min离心15 min,沉淀物用生理盐水清洗2-3次,调整菌悬液细胞浓度为108 cfu/mLCFU/mL将菌悬液分别分置3支试管中,每管5 mL,直接进行60Co辐射处理,辐射剂量为0.5 kGy,辐射后经系列梯度稀释后,涂布TTC培养基,30 ℃,培养48 h,根据菌落形态挑取青枯雷尔菌无致病力突变株突变菌株,经纯化培养后,以终浓度为20%的甘油于?80 ℃保存. (4)青枯雷尔氏菌电镜样品制备 出发菌株FJAT91和青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株在TTC平板培养基上培养青枯雷尔氏菌(出发菌株FJAT91和青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株)单细胞菌落,用注射器滴一滴清水在菌落上,用牙签刮取菌落,吸取菌液置特制的铜网上,以便于菌体的吸附.用经醋酸铀进行染色和固定,待染色的样品干燥后,装样于于JEM-100C*II/S透射电子显微镜上观察菌体形态并拍照透射电子显微镜上观察.. (5)青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株的番茄盆栽苗致病力检测 将不同途径获得的55株青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株在TTC平板上活化后,接种于SPA培养基中,170 r/min,30 ℃培养48 h,菌液稀释至108 cfu/mLCFU/mL,伤根接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上,菌株FJAT91做阳性对照(接种浓度108 cfu/mLCFU/mL),清水作为阴性对照,接种量为50 mL/盆,每个处理30盆,每天观察植株发病率.

1.2.2 青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株的防病效果评价及其模型构建 不同途径获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株经TTC平板活化后,接种于SPA培养基中,170 r/min,30 ℃培养48 h,菌液稀释至108 cfu/mLCFU/mL,伤根预接种于5-6叶龄的番茄盆栽苗上,3 d后再接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT91(接种浓度108 cfu/mLCFU/mL),单接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT91做对照,接种量为50 mL/盆,每处理30盆,每天观察番茄植株的发病情况,统计不同处理番茄植株的发病率,以青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株为样本,番茄植株的发病率、病情指数及防效为指标构建青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株的防效评价模型,从中.比较不同途径获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变株对番茄青枯病的防效,筛选出防效好防效最好的菌株,进一步研究其定殖特性,并构建其防效模型.

1.2.3 青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株FJAT1458的定殖特性 将菌株FJAT1458的培养液(含菌量109 CFU/mL)配制成108 CFU/mL、106 CFU/mL和104 CFU/mL共3个浓度,采用伤根接种法,接种番茄盆栽苗,以清水为对照.(1)不同接种浓度处理:接种5-6叶龄的番茄盆栽苗,50 mL/盆,每处理30盆.(2)不同苗龄接种处理:接种2-3叶龄和5-6叶龄的番茄盆栽苗,接种浓度106 CFU/mL,50 mL/盆,每处理30盆.(1)菌悬液的制备:将菌株FJAT1458活化于TTC平板上,30 ℃培养48 h,挑取单菌落接种于SPA液体培养基中,170 r/min,30 ℃培养48 h,经血球计数板计算,确定菌液的浓度为109 cfu/mL,将菌液浓度依次稀释到108 cfu/mL,106 cfu/mL和104 cfu/mL. (2)番茄植株的培养:将购自的番茄苗从穴盘移栽到盛满土的塑料小钵中(小钵直径15 cm、高10cm),1株/盆,浇水、施肥、除草等按常规管理.选取长势一致的壮苗用于菌株FJAT1458的定殖和防效试验. (3)不同接种浓度处理:设不同的接种浓度:104 cfu/mL、106 cfu/mL和108 cfu/mL,清水作为对照,采用伤根接种法,接种5-6叶龄的番茄盆栽苗,50 mL/盆,每处理30盆. (4)不同苗龄接种处理:分别设2-3叶龄和5-6叶龄的番茄盆栽苗接种,采用伤根接种法,接种浓度106 cfu/mL,以清水作为对照CK,50 mL/盆,每处理30盆. (5)取样和回收分离方法:番茄盆栽苗经不同接种方式处理后于接种后3、6、9、12、15、18、21、24 d取样分析,每个处理随机选取3株番茄植株,取其根系土壤、根及茎中部,采用TTC培养基分离目标菌株,根系 ……（未完，全文共29181字，当前仅显示5248字，请阅读下面提示信息。收藏《论文：青枯雷尔氏菌无致病力突变株突变菌株的构建及其防效评价模型分析》）