DNA疫苗的研究现状

DNA 疫 苗 的 研 究 现 状
刘超（复旦大学，上海市，200433）

摘要：DNA疫苗作为分子生物学发展的最新产物，可有效诱发持久的免疫反应，由于其相比普通疫苗具有一系列优点，近年来许多学者在DNA疫苗的作用机理及安全性方面做出了相当深入的研究，本文就此进行综述。
关键词：DNA疫苗； 作用机理； 安全性

经过200多年的发展，传统疫苗对于艾滋病，疟疾及肿瘤等疾病的免疫依然难以取得突破性进展，原因在于在上述疾病的预防过程中实际上起决定性作用的是由细胞毒性T细胞介导的特异性免疫，传统疫苗中只有减毒活疫苗可有效诱发细胞免疫，但其生产工艺要求较高，且有潜在致病性，一旦病毒回归到野生状态，将会对疫苗接受者造成致命威胁，存在安全隐患，难以满足实用的要求。
随着分子生物学的不断发展，新型疫苗和免疫接种手段也取得了不断的进步。1990年Wolff等 将纯化的DNA表达载体注入小鼠肌细胞观察到肌细胞内目标蛋白质的表达，确立了以重组DNA作为疫苗的概念，由于其易于制备，诱导细胞免疫持续有效，易于储存运输等突出优点，近年来科学家对其作用机理，安全性方面做了大量研究，本文就此两方面进行综述。

1 DNA疫苗的作用机理
目前在DNA疫苗的作
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成特异性CTL克隆的扩增，产生大量的效应性CTL，参与细胞免疫。外源蛋白究竟以分泌蛋白还是内在蛋白存在于肌细胞，涉及到转染的载体DNA的编码序列以及插入到肌细胞基因组的位置，往往带有随机性，因此DNA疫苗的免疫效果究竟以细胞免疫为主还是以体液免疫为主，将具有或然性。另外，肌细胞含有丰富蛋白酶，可将自身表达蛋白质加工成8～12个氨基酸的短肽并于细胞表面表达，结合MHC-I型分子，即肽回流方式。但实际上三种机制都尚未得到实验完全证实，大量学者仍在不断探究其机理以便有针对性地优化DNA疫苗。

2 DNA疫苗安全性的相关研究
1996年12月，美国食品与药物监督管理局（FDA）颁布了关于DNA疫苗的第一个指导性文件Points to consider on plasimid DNA vaccines for preventive infectious disease indications ，正式规定了DNA疫苗在生产、临床前及研究中的注意点及申报时的安全性数据种类。WHO及欧盟随后也出台了相关文件规范DNA疫苗的研究及生产。对DNA疫苗安全性的考虑主要集中在以下几方面：1.外源DNA是否会整合入基因？2.抗原是否可持续表达，且会否产生免疫耐受？3.DNA疫苗中的细菌CpG成分是否会导致免疫平衡破坏及自身免疫病？

2.1外源DNA的整合
大多数学者认为血清中的核酸酶会很快降解未被细胞摄取的外源DNA，胞内核酸酶也会降解未进入细胞核的外源DNA，研究表明小鼠肌肉注射疟疾DNA疫苗两个月后仍可检测到3～30个质粒拷贝，表明DNA有可能整合。整合后可能导致染色体不稳定，诱发肿瘤等疾病。目前使用的载体一般为环形DNA，由于介导同源重组的DNA一般应为线性，故整合概率极小，根据Temin 的预测，即使整合致癌概率也仅为10-16～10-19。但为了调控基因表达，质粒DNA常带有哺乳动物DNA短序列，目前还无法得知其整合概率。Ledwith等 提出，仅7bp的短序列插入就足以影响基因重组。但到目前为止外源DNA与宿主DNA整合的报道仍很少。
2.2免疫耐受的相关因素
DNA疫苗的一大优越性在于可以持续表达抗原，但这可能导致免疫耐受，大多数DNA疫苗的预防接种者是免疫系统发育还不够成熟的婴儿及儿童，接种后免疫系统可能将抗原识别为自身物质而引发免疫耐受。Klinman等 的实验表明编码疟疾环孢子蛋白的DNA疫苗在新生小鼠体内诱导了免疫耐受。但另外很大一部分DNA疫苗并不导致新生动物免疫耐受，且成年动物由DNA疫苗引起的免疫耐受并不十分明显，对于大于两岁的老年小鼠免疫保护有一定降低。可能原因为在幼年及老年小鼠中DNA疫苗免疫原性较弱。故DNA疫苗免疫耐受主要与编码抗原的性质及接种动物年龄有关。
2.3 DNA疫苗诱导自身免疫病的可能性研究
质粒中的CpG序列具有免疫原性，很多年前人们就发现细菌DNA可在小鼠体内诱导抗双链DNA抗体的产生，促进B细胞长时间激活，从而可能导致红斑狼疮。为了阐明CpG序列是否可以导致自身免疫病的发生发展，Mor等 统计了反复经DNA疫苗免疫的小鼠B细胞分泌的自身抗体量，发现IgG抗DNA分泌细胞的数量增加了2－3倍，血清中IgG抗DNA抗体的滴度也上升了35～60％。但这样的自身抗体水平上升并不足以引发自身免疫病或使易患病小鼠出现恶化。虽然理论上可能导致自身免疫病，但实际上还未有DNA疫苗致病的例子。另外一些研究表明，CpG寡核苷（ONDs）可能对DNA疫苗有免疫增强作用，Hemmi 等发现 ONDs序列可结合钟形受体9(toll-like receptor 9)及DNA蛋白酶激活抗原提呈细胞APCs，更多关于CpG序列的特性还有待研究，其对DNA疫苗的作用也应做进一步分析。
3. DNA疫苗的优化策略
2005年7月18日，由美国疾病预防控制中心及美国富道公司联合开发的West Nile-Innovator DNA疫苗得到美国农业部批准正式上市，成为全球首个正式上市的DNA疫苗，开创了DNA疫苗的新纪元。目前DNA疫苗的研制在全球如火如荼地进行，我国科学家对SARS病毒M基因片段的研究 已取得了一定进展，对SARS疫苗的研制提供了有利的启示。许多科学家称DNA疫苗的开发开启了第三次疫苗革命。但就目前来讲DNA疫苗技术尚不是十分成熟，仍未克服其本身免疫原性较差的缺点。对于DNA疫苗的优 ……（未完，全文共6776字，当前仅显示2379字，请阅读下面提示信息。收藏《DNA疫苗的研究现状》）