凤凰木根部病害病原物的分离及鉴定（开题报告）

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院　　　　　　　　专业班级：2009级生物技术（1）班

课题名称 凤凰木根部病害病原物的分离及鉴定

1、 本课题的研究目的和意义：
凤凰木，豆科凤凰木属，野外属濒危物种，目前已由人工引种栽培，因鲜红或橙色的花朵配合鲜绿色的羽状复叶，被誉为世上最色彩鲜艳的树木之一，故被广泛栽种为观赏树，为厦门市市树。但由于凤凰木温和的生长环境，易受根部病原菌侵染，侵染初期病症不易察觉，患病树木一般在感染后期才出现明显病征，从而造成一定的损失。研究表明，凤凰木根部的主要病原菌为褐根病病原菌（由真菌Phellinus no*ius引起），因此本课题通过对厦门市金尚路已患病而死的凤凰木根部病原菌的分离与鉴定，诊断其是否因患褐根病而死，从而作出相应的政策用于实际问题。这对于防止褐根病病害在树木间散播，以及趁早辨认该病害及作出相应的应急政策，具有一定的经济价值。


2、 文献综述（国内外研究情况及其发展）：
……（新文秘网https://www.wm114.cn省略684字，正式会员可完整阅读）……　
1）必须移除病情严重的树木和除去土壤中感染病菌的残根及子实体，然后烧毁，同时可考虑在病树与健康树间挖掘深沟，以阻隔病原。据报道指褐根病病菌可存在于泥土中的残根长达10年或更久，土壤中可能藏有带病残根，所以应将患褐根病的树木连泥土一并处理。
（2）对于病情轻微的树木，可施用克力星等药剂治疗褐根病，药剂的浓度须参考使用说明，每三个月灌注根部一次。
（3）在病区作业后，必须将工具如：刀、剪、铲及运输工具彻底消毒。



3、 本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
（1）感染组织的观察及采样：树木患褐根病的树冠会出现衰弱症状，但树冠并没有病原菌的存在，要确认树木是否患褐根病，需观察到树木茎基部及根部的病征，以黄褐色的菌丝面及受感染木材组织的黄褐色网纹为主要依据。病组织的采样，也需要采集黄褐色的菌丝面及周边组织和具有黄褐色网纹的木材组织。
（2）采用选择性培养基分离培养褐根病病原菌。
（3）提取凤凰木根部病害病原菌的DNA，并进一步进行PCR反应及鉴定。
（4）分析实验过程及实验结果。
4、 拟解决的关键问题：
（1）分离培养基的制备及相应的无菌操作。
（2）患病凤凰木根部及茎基部样品的采集及病原菌的分离及鉴定操作。
（3）PCR反应条件的控制及熟练掌握引物设计的基本原则。
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
（4）根据核酸分子大小，选择合适的电泳介质及电泳条件。


5、研究思路、方法和步骤：
（1）研究思路：本实验通过三种不同的方法由表及里，从现象到本质一步一步找出所研究的凤凰木的病因。
（2）方法：病征法是最初级也是最简单的方法；分离培养法涉及到培养基的制备，单一菌落的分离，无菌操作等技术；PCR分子诊断法涉及到核酸的提取、电泳、纯化等分子生物学的实验方法。
（3）实验步骤：
1）病征法：褐根病的特有病征表现于茎基部与根部，受害林木茎基部及根部表面常有黄色、深褐色至黑褐色菌丝面，但在根部的菌丝面常与泥沙结合而不明显。受害林木如出现上述病征就可确定为罹患褐根病。菌丝面在树皮表面凹陷处较易形成，一般鲜少生长在高于离地1公尺以上的树干。但常因林木死亡时间太长或环境气候干燥或有些树种黄褐色菌丝面不易观察。如未观察到典型菌丝面，可于茎基部及根部的树皮剥开，受感染的树皮內面及木材组织呈不规则黄褐色网纹，此黄褐色网纹亦可视为褐根病的特有病征。如果仍未观察到典型菌丝面与黄褐色网纹，可将感染的木材组织放置在封口塑料袋内，保持高相对湿度2-5日，病组织表面可形成黄褐色菌丝面。有些患褐根病树木的茎基部可观察到黄褐色到黑褐色的平伏至具菌盖的子实体，子实体比菌丝面坚硬且有细小菌孔。
（2）分离培养法：对于枯死已久的林木，利用病征法有时无从判断是否为褐根病，则可用分离培养法来确定枯死树木是否为褐根病。利用褐根病菌选择性培养基进行分离培养感染腐朽的木材。将感染腐朽木材的表面泥土刷干净，切成小块。大小约0.5 * 0.5 * 0.5㎝3，每一感染腐朽木材切取10-20小块，以每个培养皿放入4小块，将接好小 ……（未完，全文共5473字，当前仅显示1922字，请阅读下面提示信息。收藏《凤凰木根部病害病原物的分离及鉴定（开题报告）》）