碱性蛋白酶生产菌株vv8酶学性质研究（开题报告）

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院　　　　　　　　 专业班级：2009级生物工程（2）班

课题名称 碱性蛋白酶生产菌株vv8酶学性质研究

1、本课题的的研究目的和意义：
1.1研究目的：新型蛋白酶8的分离纯化及酶学性质分析
1.2研究意义：在实验室条件下培养产低温蛋白酶菌株VV8后收集粗酶液，然后运用离心、冷冻干燥、DEAE-52 柱层析、Sephade* G-75 凝胶过滤等技术将碱性蛋白酶进行提纯，得到纯酶后进行蛋白酶特性研究。对酶的特性研究包括以下方面：最适酶活的pH、温度的测定，抑制因子对酶活影响测定。最后再将所得数据进行分析汇总。为之后碱性蛋白酶的生产应用奠定研究基础。

2、 文献综述（国内外研究情况及其发展）：
蛋白酶( Protease)是水解蛋白质的一大类酶的通称，广泛应用于食品、洗涤添加剂、饲料、造纸、制药等行业，占世界用酶市场60%以上的份额。低温蛋白酶是一个相对概念，其最适作用温度通常比同功能的中温(50℃)蛋白酶要低 20－30℃左右，且在较低的温度下(0－20℃)拥有较高的酶活性，而在高温条件下(＞ 60℃)的酶活性较差。正是由于这些特点使得低温蛋白酶在食品加工业、冷水洗涤剂、动植物抗冻医用疫苗以及生物保鲜方面有着普通
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目前,我国碱性蛋白酶研究已经达到了分子水平,利用基因工程手段和蛋白质工程手段定向改造以提高碱性蛋白酶产生菌产酶活力及酶学性质是今后很长时间的一个发展趋势。随着基因工程技术研究的深人和应用技术手段的完善,碱性蛋白酶研究将会进人一个全新的阶段。
3、 本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
3.1主要研究内容：
本课题在实验室条件下培养产低温蛋白酶菌株VV8后收集粗酶液，，通过LOWRY法对菌株VV8进行蛋白酶活性测定，而后运用离心、冷冻干燥、DEAE-52 柱层析、Sephade* G-75 凝胶过滤等技术将碱性蛋白酶进行提纯，并研究该蛋白酶的最佳pH值，最适温度，酸碱稳定性以及热稳定性，以及抑制剂对酶活的影响。
（1）产酶菌株的培养
（2）粗酶的制备；；
（3）低温蛋白酶的分离纯化
（4）低温蛋白酶的酶学性质研究

3.2成果形式：以数学模型和论文的形式提交成果。

4、拟解决的关键问题：

粗酶性质的研究；分离纯化目标蛋白酶；纯酶酶学性质研究。

5、研究思路、方法和步骤：
5.1产酶菌株的培养；
菌株的活化培养：将冷冻保存的菌株VV8接种到明胶平板上，待长出菌落后将其接种于20ml 2216E液体培养基中，在250rmin/30℃条件下摇瓶培养3d，作为种子培养液。而后以5%的接种量，100ml培养，30℃下摇瓶培养3天。
5.2粗酶的制备
粗酶液的制备：将培养好的菌液进行离心（10000rpm，10min），取上清，然后进行抽滤，取5ml于4℃保存，待用，测初酶活及蛋白含量测定。
5.3低温蛋白酶的分离纯化
（1）发酵液的冷冻浓缩
将粗酶液分装在合适的敞口容器中，然后放置于-20℃中冷冻凝固，之后放入冷冻干燥机中冻干2 d，冻干后取适量样品用无菌水溶解，于-20℃储存。剩余冻干样品粉末进行封装，于4℃保存。
（2）透析袋的预处理及透析
将透析袋预处理后，将冻干溶解后的样品装入透析袋中，两端用夹子夹紧密封，放入盆中用自来水透析过夜，期间多次换水；之后再以蒸馏水透析12~15 h。透析完成后取出酶液，瞬时离心去除不溶物，并将酶液放于-20℃保存。
（3）再次冷冻干燥2d；
（4）DEAE-52 柱层析进行离子纯化
（5）Sephade* G-75 凝胶过滤，进行验证，回收浓缩得纯酶。
5.4 蛋白酶的理化性质的分析
(1) SDS-PAGE测定蛋白酶分子量及纯度
(2) 蛋白活性电泳
（3）酶的最佳温度测定及热稳定性
（4）酶活最佳pH测定及pH稳定性
（5） 抑制因子对酶活的影响测定
5.5酶活及蛋白含量的测定
本实验采用LOERY法测定酶活力及蛋白含量，蛋白酶可水解酪蛋白，产生的酪蛋白可以和福林试剂反应产生稳定的蓝色化合物，在一定浓度范围内，所产生的蓝色化合物颜色深浅与酪蛋白含量之间存在线性关系，因此可通过酪蛋白含量标准曲线算出样品酶活。
(1)Tyr标准曲线的制作
(2)酶活力测定

6、本课题的进度安排：
(1) 2.28-3.5 文献阅读，实验方案确立。
(2) 3.6-4.30 实验实施阶段。
(3) 5.1-5.20 数据统计、补充实验及论文写作和修改。
7、参考文献：
[1] 胡学智, 王俊.蛋白酶生产和应用的进展，工业微生物2008,38,4:49-61
[2] 包巨南,兰立新. 微生物源碱性蛋白酶研究进展[J]. 贵州化工. 2007(06) ,32,6:20-23
[3] 万琦,陆兆新,高宏. 低温碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的研究[J]. 微生物学杂志,2002,22,(05):16-24
[4]LM Zanphorlin, H Cabral, E Arantes, et al. Purification and characterization of a new alkaline serine protease from the thermophilic fungus Myceliophthora sp[J].Process Biochemistry 2011,46:2137-2143
[5]刘静. 产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究[D].浙江大学,2005
[6] 顾燕玲,徐宇丽,史学伟,郑晓吉,周红,倪永清. 天山1号冰川底部沉积层产β-半乳糖苷酶低温菌株的的筛选及其系统发育[J]. 微生物学报,2013,53,(2):164-172
[7] C. R. Tremacoldi ,R. Mont ……（未完，全文共4915字，当前仅显示2482字，请阅读下面提示信息。收藏《碱性蛋白酶生产菌株vv8酶学性质研究（开题报告）》）