论文开题：固定化木聚糖酶用于生物反应器的研究

大学本科毕业论文(设计)开题报告

课题名称 固定化木聚糖酶用于生物反应器的研究

1、 本课题的的研究目的和意义：
木聚糖酶(*ylanase)是降解木聚糖酶系中最关键的酶，在饲料、食品、纺织、造纸等行业应用广泛，是重要的工业用酶之一。但该酶稳定性差、保质期短、重复利用率低、应用成本高，因此木聚糖酶的广泛应用受到了一定的限制[1]。类弹性蛋白(Elastin-like polypeptides，ELPs)具有对温度及盐浓度等敏感相变的性质，通过可逆热循环(Inverse thermal cycling，ITC)方法纯化蛋白可以达到有高效的，成本低廉的特点。通过基因融合的方法合成木聚糖酶-类弹性蛋白的重组蛋白，利用类弹性蛋白的可逆相变性质将重组蛋白纯化出来，得到固定化木聚糖酶。将固定化木聚糖酶用于生物反应器，使定向固定与木聚糖酶的催化反应同时进行，这种方法比较温和，节省了纯化步骤的开支，同时更有利于应用于大规模的工业生产。研究固定化木聚糖酶用于生物反应器的动力学参数，进一步优化反应条件，可以为酶膜反应器以及工业生产奠定基础。
2、 文献综述（国内外研究情况及其发展）：
定向固定主要是通过不同的方法,将酶的特定位点与载体连接, 使酶在载体表面按一定的方向排列, 使它的活性位点面朝固体表面的外
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其中有大部分的重组蛋白没有回复可溶的状态，只有很少一部分的变为可溶状态，原因可能是重组蛋白在发生想变时与杂蛋白一起聚集成颗粒，很多杂蛋白与酶镶嵌在一起甚至包裹着酶从而使得酶无法回复能可溶的状态，但是ELP连接的重组蛋白可以作为分子定向固定，而且这种定向固定化是通过共价键连接，连接的非常稳定。因此研究这种分子标签作为载体的定向固定有很大的意义。
生物反应器，是指利用酶或生物体（如微生物、动植物）所具有的特殊功能，在体外进行生物化学反应的装置系统。本实验是研究固定化木聚糖酶催化木聚糖酶水解的反应，故使用的反应器又可称为酶反应器。酶反应器可以分为[12]：分批式反应器、连续流反应器以及中空纤维反应器等。其中，分批反应器为最简单的酶反应器，只需要加入固定化酶，使其悬浮于搅拌罐中，这种反应的速度决定于搅拌速度。而本实验是将固定化木聚糖酶与木聚糖置于适宜条件下的恒温水浴磁力搅拌器中，让其可以在适宜的搅拌速度下均匀稳定的进行酶促反应，属于间歇式酶反应器[13]。通过测定反应过程中不同时间内的木聚糖水解度，构建数学模型，从而进一步分析该反应的动力学参数[14]，最终确定该酶促反应所具有的最适反应条件，例如：底物最适浓度、反应器有效体积等。

3、 本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
类弹性蛋白具有对盐浓度和温度敏感的相变性质可以用来纯化与其相连接的蛋白质。本实验首先对含有类弹性蛋白-木聚糖酶重组蛋白的大肠杆菌进行扩大培养，通过离心得到菌体之后，进行细胞破碎。将木聚糖酶置于高于相变温度的环境中，之后再置于相变温度之下的环境中，大部分呈现聚集状态的固定化酶不能很好的恢复到松散的状态，因而研究相变温度之上的聚集态固定化酶的性质。利用ITC可逆相变循环的方法纯化出一小部分重组蛋白，大部分的酶定向固定在ELP标签上，将固定化木聚糖酶用于生物反应器中，使其与木聚糖进行酶促水解反应，通过设定反应器中的适于酶促反应的条件，使酶促反应可以在温和持续不变的反应条件下反应完全，通过实验考察得到固定化木聚糖酶的动力学参数，重复利用次数、最适反应时间以及反应器的有效体积等，并优化生物反应器中酶促反应的最佳条件。
4、拟解决的关键问题：
（1）、提高固定化木聚糖酶的回收率。
（2）、固定化木聚糖酶用于生物反应器时最佳反应条件的确定。
5、研究思路、方法和步骤：
（1）、将含有类弹性蛋白-木聚糖酶的重组蛋白的大肠杆菌扩大培养；
（2）、将收集到的大肠杆菌进行超声波破碎；
（3）、对破碎的菌体进行ITC可逆相变循环，收集固定化木聚糖酶；
（4）、固定化木聚糖酶用于生物反应器中的反应条件的优化；
（5）、测定固定化酶可以重复利用的次数；
（6）、测定并分析固定化酶用于生物反应器中的动力学参数。
6、本课题的进度安排：
2013年3月1日至2013年3月20日，有关文献的查找。
2013年3月21日至2013年4月5日，固定化木聚糖酶的提取、纯化以及酶活的测定。
2013年4月10日至2013年5月， 构建固定化木聚糖酶反应器，测定相关参数:固定化木聚糖酶重复利用次数、反应初速度、反应常数等。
2013年5月至6月， 写论文，准备毕业答辩。
7、参考文献：
1. 张丽萍, 陈晨, 殷婷婷, 等. 固定化木聚糖酶的应用研究进展[J]. 化学世界, 2010, 636(1)(11):697-700.
2. Wilchek M, Miron T. Oriented versus random protein immobilization. J Biochem Biophys Methods 2003,55:67-70.
3. Gaj T, Meyer SC, Ghosh I. The AviD-tag, a NeutrAvidin/avidin specific peptide affinity tag for the immobilization and purification of recombinant proteins. Protein e*pression and purification 2007,56:54-61.
4. Kuan I, Liao R, Hsieh H, Chen K, Yu C. Properties of Rhodotorula gracilis d-Amino Acid O*idase Immobilized on Magnetic Beads through His-Tag. Journal of bioscience and bi ……（未完，全文共4966字，当前仅显示2508字，请阅读下面提示信息。收藏《论文开题：固定化木聚糖酶用于生物反应器的研究》）