论文开题：北极产蛋白酶菌株VV8、VV9及VV52的分类鉴定

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院　　　　　　　　　　　　　专业班级：　　生物技术专业

课题名称 北极产蛋白酶菌株VV8、VV9及VV52的分类鉴定

1、本课题的的研究目的和意义：

(1)本研究对菌株VV8和VV9进行分类鉴定，阐明细菌与其他类群之间的亲缘关系。
(2)对极地微生物的测定作初步探索，并为极地微生物产低温蛋白酶的低温适应性研究和其实际应用打下一定的基础 。

2、文献综述（国内外研究情况及其发展）：


20世纪70年代以前，生物类群间的亲缘关系主要是根据形态结构、生理生化、行为习性等表型特征以及少量的化石资料来判断它们之间的亲缘关系。这些方法至今仍作为微生物的判断依据之一。
自从1675年，荷兰商人Leeuwenhock自制了第一架显微镜，并首先观察到被他称为“微小动物”的第一个微生物以来。随着其他
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（蛋白质、RNA、DNA等）在进化过程中的作用及其变化规律有了进一步认识，因此研究微生物的系统发育主要是分析和比较生物大分子的分子序列作为判断各类生物进化谱系的主要指征。60-70年代，有些科学家通过比对某些蛋白质分子（如细胞色素C）的氨基酸顺序进行生物谱系分析。1981年，美国学者Carl Woese发现了测量所有微生物进化关系的尺子：rRNA作为进化的指征并建立16SrRNA系统发育树。为了简化测定过程，前后的几十年间先后出现了另外一些方法，例如，测定核酸的碱基组成[(G+C)%]及分子杂交，血清学试验，噬菌体分型
，氨基酸顺序，蛋白质分析，细胞壁等细胞成分。


近20多年来，随着微电子、计算机、分子生物学、物理及化学等先进技术向微生物领域的_和多学科的交差，微生物的快速鉴定和自动化分析技术取得了突破性进展。例如三大鉴定系统： API 细菌数值鉴定系统，Enterotube 系统，Biolog 全自动或手动细菌鉴定系统；生物芯片的自动化运用；生物信息学的建立及其检索数据库的运用（NCBI、EMBL、DDBJ）。

2、 本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：

主要内容：本课题主要对分离自北极的蛋白酶产生菌株VV8、VV9以及VV52进行分类鉴定，探索其系统进化地位。实验内容包括16S rRNA 基因全长克隆测序及序列分析、生理生化特征实验、DNA中G+C mol%测定等。


成果形式：以数学模型和论文的形式提交成果。
4、拟解决的关键问题：

拟解决的关键问题：对优化过程中若干参数的相互影响与干扰进行细致调节，努力获得全局化考量。

5、研究思路、方法和步骤：

5.1 16S rRNA 基因全长克隆测序及序列分析
（1）菌种平板划线接种
通过平板划线法进行菌种活化及获取单一菌落，为后续实验做准备。实验菌:分离自北极的蛋白酶生产菌株VV8、VV9及VV52；受体菌：大肠杆菌TOP10F菌种。培养后4℃保存备用。
（2）细菌总DNA的提取
先分别取VV8、VV9、VV52以及TOP10F单一菌落接种于适量LB液体培养基进行菌株活化，再使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。取少量基因组进行电泳定性检测，其余置于-20℃ 保存，备用。
（3）琼脂糖凝胶电泳
（4）16S rRNA基因PCP扩增
（5）PCR 产物纯化
（6）连接反应
（7）感受态细胞的制备
（8）感受态细胞效价
（9）pMD18-T Vector转化
（10）菌落PCR
（11）16SrRNA基因全长测序
（12）16S rRNA基因核酸内切酶酶切反应
（13）聚丙烯酰胺凝胶电泳
（14）16S rRNA基因序列分析
5.2 高效液相色谱法测定基因组DNA 中G＋C mol％含量
1） DNA 定量
2） DNA 的水解
3） 色谱分离条件
5.3细菌的生理生化试验






6、本课题的进度安排：
1）第1周：查阅相关文献资料，熟悉实验室的基本操作流程和规范，了解菌株鉴定的方法。根据所查相关文献资料进行实验准备。
2）第2-6周：16S rRNA 基因全长克隆测序及序列分析 ……（未完，全文共2776字，当前仅显示1764字，请阅读下面提示信息。收藏《论文开题：北极产蛋白酶菌株VV8、VV9及VV52的分类鉴定》）