毕业论文：新型产柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的筛选及其鉴定

题目：新型产柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的筛选及其鉴定

院（系） 化 工 学 院 ＿
专 业 生 物 技 术

新型产柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的
筛选及其鉴定
摘要
柑橘类水果果汁的深加工过程中会产生严重的苦味，使用柚苷酶进行酶法脱苦可以收到良好的效果。此外柚苷酶在其他食品、医药等众多领域内有着广泛的应用，其经济效益越来越得到重视。柚苷酶来源十分广泛，但目前国内外的研究主要集中于真菌和酵母菌上，对产柚苷酶细菌的研究较少。本研究通过对土壤中细菌的富集培养筛选出一株柚苷酶高产菌Wb51b。从形态学特征、生理生化特性和16S rDNA等方面对菌株Wb51b进行鉴定，分析结果表明菌株Wb51b为叶杆菌属(Phyllobacterium)。根据形态学特征鉴定结果表明该菌株为革兰氏阴性，其生理生化特征经由对照鉴定手册，表明其与模式菌株有区别。最后，对该菌株的生长情况和柚苷酶的表达进行研究，结果表明其酶的表达情况与菌株的生长情况基本一致，同时在时间为64h左右时达到最大值，分别为58.7U/mL和OD600为0.63。
关键词: 柚苷酶；脱苦；细菌鉴定



Screening and identification of Phyllobacterium sp.Wb51b, a new naringinase producer
Abstract
Citrus fruit juices will give serious bitterness durin
……（新文秘网https://www.wm114.cn省略1144字，正式会员可完整阅读）……　

目录
摘要 I
Abstract II
目录 III
1绪论 1
1.1柚苷酶 1
1.2柚皮苷 1
1.3柚苷酶高产菌株的筛选 2
1.3.1产柚苷酶细菌的筛选 2
1.3.2产柚苷酶真菌的筛选 2
1.4柚苷酶的应用 3
1.4.1柚汁加工 3
1.4.2其他应用 3
1.5本论文研究的目的、意义及内容 4
2材料与方法 5
2.1实验材料 5
2.1.1样品来源 5
2.1.2主要试剂 5
2.1.3主要仪器和设备 5
2.1.4培养基及溶液 6
2.2实验方法 7
2.2.1采样 7
2.2.2富集培养 7
2.2.3初筛 7
2.2.4复筛 7
2.2.5菌种保藏 8
2.3菌种的鉴定 8
2.3.1培养特征 8
2.3.2形态特征 8
2.3.3系统发育特征 8
2.4生理生化特征 11
2.5检测与分析方法 11
3结果与讨论 14
3.1菌种的筛选 14
3.2选取目的菌株 14
3.3形态学特征 15
3.3.1 菌落形态 15
3.3.2革兰氏染色 16
3.3.2生理生化特征 16
4 结论与展望 21
参考文献 22





1 绪论
1.1 柚苷酶
柚苷酶广泛存在于各种丝状真菌，在其他各种微生物体、多种动植物体组织中也有发现。Hall在1938年首次发现芹菜种子中的柚苷酶[1]。因其水解活性可使柑橘类果汁脱苦，柚苷酶有着广阔的工业生产应用前景。
柚苷酶（Naringinase）是一种复合水解酶，包含ɑ-L-鼠李糖苷酶（ɑ-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）和 β-D-葡萄糖苷酶（flavonoid-β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21）这两种酶的活性。它可以将柚皮苷（Naringin）水解成鼠李糖和普鲁宁，并进一步水解得到葡萄糖和柚皮素（Naringenin）。其水解过程如图1所示。












1.2 柚皮苷
柚皮苷的分子式是C22H32O14，分子量580.53，化学名称是4,5,7-三羟基黄烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，主要存在于柚子及柑橘类水果的果皮和种子中，果肉中含量相对较少。它溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀碱溶液和热水，常温下在水中的溶解度为0.1%，75℃时可达10%，不溶于石油醚、乙醚、苯和氯仿等非极性溶液[3]。
据报道，柚皮苷具有抗癌、抑菌、抑酶、抗氧化、降血胆固醇、降低毛细血管脆性、改善微循环、治疗非典型性肺炎等生理活性，在医药和食品等领域具有极大的应用价值[4]。
1.3 柚苷酶高产菌株的筛选
1.3.1 产柚苷酶细菌的筛选
产柚苷酶的细菌报道比较少见，主要是因为这些产柚苷酶的细菌在工业上具有很多好处，导致很多学者对细菌产柚苷酶的研究秘密进行 [5]。尽管这样，最近还是有学者对细菌产柚苷酶进行了文献报道。Gaston Orillo[6]等从南极海水中分离获得Pseudoalteromonas和Ralstonia pickettii，在-1-8℃的低温条件下具有ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Hashimoto[7]等发现以兰胶为碳源的S. paucimobilis和Bacillus sp. GL1具有很高的ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Beekwilder[8]和Avila[9]等在乳杆菌属中发现具有ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Puri和Kaur[10]等分离获得一株具有α-L-鼠李糖苷酶活性的Staphylococcus *ylosus。该菌株经优化后，柚苷酶的产量到达8.45U/mL[11]。用5L发酵罐优化后，在糖浓度15g/L时其产量达到8.91U/mL[12]。
1.3.2 产柚苷酶真菌的筛选
产柚苷酶的真菌研究是一个相对成熟的方面，目前商业化的柚苷酶也是来自于真菌，如来自于美国的Sigma公司就有商品柚苷酶，该商品酶产自青霉。
Puri和Kalra[13]利用黑曲霉MTCC1344获得胞外柚苷酶，其中糖蜜和蛋白胨是最佳的碳源和氮源，培养基中加入金属离子可以提高酶的产率。Busto等[14]从黑曲霉CECT2088中诱导获得柚苷酶。同年，Birgisson等[15]从E.coli中获得ɑ-L-鼠李糖苷酶并设计出一个反应器用于柚皮苷的水解。为了获得新的柚苷酶来源，Thammawat等[16]于2008年在中国台湾分离获得348株真菌，研究表明柚苷酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和4.0。其中黑曲霉BCC25166被用于进一步的研究，结果显示在对发酵过程优化获得酶活最高的条件是3.75g/L鼠李糖为碳源和2.5g/L硝酸钠为氮源。Chang等[17]分离获得酱油曲霉具有很高的柚苷酶活性,研究表明该酱油曲霉产的柚苷酶能够对食品方面的脱苦有很好的效果。
李利君等[18]获得一株产柚苷酶的酵母菌--罗伦隐球酵母Jmedeb008，其中该酵母的柚苷酶产酶受到葡萄糖效应的影响。
1.4 柚苷酶的应用
1.4.1 柚汁加工
柚子为双子叶植物纲无患子目芸香科柑橘属植物，乔木。果实呈圆球形、扁圆形、梨形或阔圆锥形，横径通常10厘米以上，淡黄或黄绿色。柚子含有丰富的蛋白质、有机酸、维生素以及钙、磷、镁、钠等人体必需的元素，每100g可食用部分含水88.4g、蛋白质0.7g、脂肪0.6g、糖10.2g、钙41mg、磷43mg、铁0.9mg[19]。柚子对高血糖、高血压、高血脂、糖尿病、血管硬化等疾病有较好的辅助治疗作用。
我国有着丰富的柑橘资源，但柑橘加工过程的瓶颈在于产生的苦味难以消除，其苦味物质是柠檬苦素和柚皮苷，而柚皮苷是主要苦味物质。工业上一般采用中性多聚吸附剂或微酸吸附树脂进行吸附脱苦，但成本较高且会破坏果汁原有的营养成分。采用柚苷酶水解柚皮苷不仅可使苦味降低90%以上，而且作用专一，不会对果汁风味和营养成分有任何影响[20]。汪钊 ……（未完，全文共17854字，当前仅显示3211字，请阅读下面提示信息。收藏《毕业论文：新型产柚苷酶菌株Phyllobacterium sp.Wb51b的筛选及其鉴定》）