论文开题：米曲霉为宿主菌的基因高效转化系统建立

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院　　　　　　　　　　　　　专业班级：08生物工程1班　

课题名称 米曲霉为宿主菌的基因高效转化系统建立

1、本课题的的研究目的和意义：

丝状真菌中的米曲霉生长迅速、易于培养、有着很高的蛋白分泌能力，且又是公认的食品安全生产菌株，发酵及后处理技术成熟，是我国重要的微生物资源。故经过一定的改良，其可构建使目的基因高效表达的米曲霉代谢工程菌。
CaCl2-PEG介导原生质体转化法是丝状真菌最常用的转化方法，其中原生质体的制备率和再生率会直接影响进一步的基因转化效果。本实验课题研究和优化米曲霉原生质体形成以及细胞壁再生的条件，以提高米曲霉基因转化效率，为进一步的基因改造工作奠定基础。

2、 文献综述（国内外研究情
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为困难，所以这方面研究的深度和广度，比菌丝分离原生质体有较大的差距[6]。
国内米曲霉原生质_备研究中主要采取了单因素法和正交实验设计法，在已有的最佳米曲霉原生质_备的条件下[7]，本课题以探究菌龄[8],酶解温度、酶解时间、酶液浓度、酶体系[9][10]，菌丝预处理方式、再生培养方式[11][12]等条件对米曲霉原生质_备的影响。本课题将综合各种文献并在实际实验的基础上，探究和完善米曲霉原生质_备的方法，为进一步的基因改造工作奠定基础。

3、 本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
本课题以米曲霉分生孢子为对象制备原生质体，对影响原生质_备和再生的条件，包括培养条件、菌龄、酶解温度、酶解时间、酶液浓度，菌丝预处理、再生培养基等进行研究，确定制备米曲霉原生质体的最优化条件，为构建高效转化系统奠定基础。 米曲霉制备原生质体，有两种基本方式：一种是利用米曲霉菌丝_备；另一种是利用米曲霉孢子制备。本课题中除了分别对两种方法做出制备条件探索外，还会进行对比试验，以更加完善米曲霉原生质_备的条件优化。
本课题致力于米曲霉原生质_备研究，主要的成果展示为米曲霉菌株展示，其中包含了一些实验测的的数据以及和国内研究情况的对比分析。最终的成果主要以实验数据和实物图来组合展示，已提供直接的学习、研究材料，以备今后做进一步的探究。

4、拟解决的关键问题：

1.米曲霉分生孢子制备原生质体比菌丝更困难，如何顺利完成其原生质_备；
2.优化原生质_备方法，提高制备率和再生率，以最终提高转化效率。

5、研究思路、方法和步骤：

研究思路和步骤：
1、平板法培养米曲霉菌株P-5；
2、蜗牛酶+纤维素酶混合酶液，对P-5作用制备原生质体，此处进行多项单因素探究实验；
3、在探究各种单因素的变化对米曲霉原生质_备的影响时，主要通过显微镜原生质体观察计数法来计算原生质_备率，表征各因素最佳值；
4、在各种相关因素探究完成后，进行组合实验法，控制各种因素的最佳值进行原生质体再生，计算制备率和再生率。
原生质_备率 ＝（A-C）/A*100%
原生质体的再生率＝[(B-C)/(A-C)]*100%
备注：A为对照菌液再生菌落数
B为制备得原生质体在高渗培养基生长菌落数
C为原生质体在普通培养基上生长的菌落数。

主要的研究方法：
1、本课题中，经过对相关的文献阅读和一定的实验比较，建立了米曲霉玻璃纸平板培养法的实际操作体系；
2、本课题中对原生质体的破壁，采用了蜗牛酶+纤维素酶混合酶液酶解法；
3、本课题中需要探究相关条件对米曲霉原生质_备的影响，故采取了单因素法以及多因素组合法进行实验研究，以探索优化条件；
4、本实验中，采取了两种实验结果展示的方法：第 ……（未完，全文共3056字，当前仅显示1543字，请阅读下面提示信息。收藏《论文开题：米曲霉为宿主菌的基因高效转化系统建立》）