毕业论文：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究

题目：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究
院 （系） 化工学院
专 业 生物工程
届 别 2012届


米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达
及其酶学性质研究
摘 要
戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway, PPP）是生物体糖代谢的重要途径之一，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH, EC 1.1.1.49）是PPP途径最关键的氧化还原酶之一，它催化的反应伴随着还原力NADPH和6-磷酸葡萄糖酸-δ-内脂的生成，参与氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成代谢，对细胞正常生长和代谢有重要影响。同时，G6PDH表达水平调控着葡萄糖糖酵解途径转向PPP途径的代谢流进而影响胞内NADPH的浓度。
本论文成功表达了来源于米曲霉的G6PDH基因（gsd），并对经表达、纯化后的酶进行了酶学性质研究，为今后米曲霉PPP途径代谢调控研究奠定基础。主要研究结果如下：
以米曲霉CICC2012为实验菌株，提取米曲霉总RNA，反转录PCR（RT-PCR）得到菌株的全长cDNA。以cDNA为模板，根据NCBI上报道的gsd的mRNA序列，设计引物，采用融合PCR技术，扩增出gsd的cDNA片段，构建重组表达载体pET-32a-cDNA-gsd，并转化到大肠杆菌E. coli BL21(DE3)，成功诱导大肠杆菌过量表达gsd。序列测定和结果分析表明，gsd基因序列大小为1888 bp，含有355 bp内含子，开放阅读框长度为1533bp，编码510个氨基酸，蛋白亚基分子量约为59 kDa。
大肠杆菌表达的G6PDH，经Ni2+柱纯化得到电泳级纯化蛋白，G6PDH酶活性与大肠杆菌粗酶液相比，由12.94 U/mg提高到73.6 U/mg，G6PDH纯化倍数为5.69，纯化的回收率为56.3%。
工程菌表达纯化后G6PDH的最适反应pH为7.5，最适反应温度分别为40℃，Mg2+、Ca2+和Mn2+对G6PDH酶活力具有促进作用，Co2+、Cd2+、Hg2+ 和Zn2+对其酶活力具有强烈的抑制作用。

关键词：米曲霉；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；表达与纯化









Gene e*pression in Escherichia coli and enzymatic properties of G6PDH from Aspergillus oryzae
Abstract
Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, EC 1.1.1.49) is one of the key enzymes of pentose phosphate pathway, which generates reducing power NADPH and 6-phosphate gluconic acid-δ-fat, involved in the anabolic of amino acids, lips and nucleotides, plays an important role in normal cell growth and metabolism. The e*pression level of G6PDH regulates the metabolic flu* of glucose glycolytic pathway turn to the PPP pathway, thereby affecting the concenctration of intracellular NADPH.
In this paper, G6PDH gene (ecoded by gsd) were e*pressed and purifiedfrom Aspergillus oryzae. The purified enzymes were also characteriazed. The research will lay the basis for the metabolic regulation of PPP from Aspergillus oryzae. The main findings were as follows:
The totoal RNA of Aspergillus oryzae was e*tracted and the full length cDNA of A.oryzae CICC2012 was got by RT-PCR. According to the amino acid sequence of gsd reported on NCBI, the primers were desgined. The cDNA-gsd was amplified by fusion PCR technology using cDNA of Aspergillus oryzae CICC2012 as the template. The amplified cDNA-gsd were then connected with pET-32a(+) to construct the recombinant vector pET-32a-cDNA-gsd, then successfully induced the over-e*pression o
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糖和4-磷酸赤藓糖）和还原力NADPH的含量，前者是生物重要的合成原料，后者则是许多生物合成反应的专一性电子供体，可通过细胞色素系统或转氢酶系统重新产生ATP，确保植物及时利用ATP释放的能量，参与合成与抗冻性发育有关的蛋白质和脂类物质，从而增强植株对低温的适应性，有助于幼苗抗冻性的提高。
随着基因工程和代谢工程的发展，近几年对G6PDH的研究由植物领域逐渐转向微生物领域。Cécile等[8]构建了G6PDH基因缺失的大肠杆菌工程菌，通过同位素通量分布技术分析基因修改后大肠杆菌中心碳代谢的碳代谢流，并将其与G6PDH基因过量表达工程菌和野生菌株进行对比，以期确定特定的基因修改对离体状态下大肠杆菌中心碳代谢流的影响，结果表明代谢流不但通过G6PDH酶活性的生化调控受到严格控制，而且也与PPP途径中G6PDH的下游反应间接相关。Hua等[9]研究了在葡萄糖限制培养和氮限制培养条件下的大肠杆菌葡萄糖磷酸异构酶基因和G6PDH基因缺失对中心碳代谢流的影响，敲除葡萄糖磷酸异构酶基因后PPP途径成为葡萄糖代谢的主要途径，在葡萄糖限制培养条件下G6PDH基因缺失对中心碳代谢没有产生明显的影响，而在氨限制培养条件下，葡萄糖磷酸异构酶基因和G6PDH基因的突变引起了大范围的溢出代谢，三羧酸循环（TCA循环）的代谢流通量显著下降，研究还发现氨限制培养条件下，G6PDH基因在PPP途径代谢生成NADPH过程发挥着重要的作用。Chen等[10]对大肠杆菌进行基因工程改造，获得芳香途径的代谢中间物，代谢通量分析发现G6PDH基因是碳代谢流改造的关键节点，该研究为今后更有效的操作以改变大肠杆菌生理特征奠定了基础。
G6PDH在真菌中也有广泛研究，但在曲霉中的研究相对较少，特别是在米曲霉中更少有报道。Scott[11]从Neurospora crassa中分离纯化了G6PDH蛋白，并对其进行了酶学性质分析，研究结果表明，G6PDH是一个二聚体蛋白质，以葡萄糖-6-磷酸为底物时Km为0.037mM，NADP+为辅酶时Km为0.012 mM，最适pH和温度分别为7.4和25℃。Kato等[12]首次分离纯化了分离纯化了念珠菌的G6PDH蛋白，研究发现ATP、GTP、甘油醛-3-磷酸、NADPH均对G6PDH蛋白的活性产生抑制作用，最适pH为8，最适温度为55℃。曲霉中关于G6PDH的研究，目前还仅限于通过离子交换层析和亲和层析的方法分离和纯化G6PDH，做初步的酶学性质分析。Niehaus等[13]通过亲和层析分离纯化了寄生曲霉中的G6PDH，研究发现Cd2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等金属离子都不同程度抑制了G6PDH的酶活性，其中Zn2+对其活性具有强烈抑制作用，酶最适合pH为7.4，最适温度为30℃。Ibraheem等[14]分离并纯化了棘孢曲霉中的G6PDH，Co2+、Zn2+、NADPH、6-磷酸果糖都抑制了酶活性，且特异性地以NADP+为辅酶，当以NAD+为辅酶时，没有活性。Lambert等[15]通过亲和离子交换层析的方法纯化了黑曲霉和构巢曲霉的G6PDH，并对这两种曲霉的G6PDH分别进行了酶学性质研究，
1.4融合PCR技术
融合PCR技术（fusion PCR）采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的 PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意 DNA 片段连接起来。陈国梁等[16]认为，此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现 DNA片段的体外连接, 为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。
随着许多基因组测序计划的完成及大量表达序列标签数据库（bEST）的建立，基因组研究已由结构基因组逐渐转向了功能基因组研究[17]。李敏等[18]利用同源重组技术手段，通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因，从而探讨目的基因与表型性状间的关系，是研究动物、植物、微生物基因功能的一种有效的遗传操作方法。
同源重组的发生依赖于载体与目的片段间存在一定的同源片段，同源片段越长越有利于同源重组事件的发生[19]。传统的同源重组载体的构建是以限制性内切酶和DNA连接酶为基础，通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来，方法费时费力，不但在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列，而且在进行长片段连接时，容易出现难以找到合适的酶切位点的问题。为了克服传统的同源重组载体构建方法的缺陷，刘亮伟等[20]对融合PCR技术进行进一步改进，加入自我延伸过程。研究表明自我延伸程序中的延伸时间是影响融合基因扩增浓度的关键因素。现有的融合PCR技术一般是通过两个阶段：第一阶段先应用特异性引物，对各片段进行独立扩增，特异性引物的5c末端带有一段相邻片段的互补序列；第二阶段在同一反应体系中加入各片段的混合物，以一对外侧引物进行融合片段的全长扩增。由于融合PCR技术正处于初步发展阶段，在应用过程中还存在很多问题，如融合产物长度一般在4.0 kb以下、待融合片段的个数一般不超过3个产物特异性差等。
1.5 研究内容及意义
米曲霉（Aspergillus oryzae）是一种重要工业微生物，应用于食品加工和发酵工业已有几千年历史。米曲霉是公认的食品安全菌株，由于其发酵及后处理技术成熟的特点，被认为是研究基因表达和蛋白质分泌的理想对象。戊糖磷酸途径是生物体糖代谢的重要途径之一。G6PDH是PPP关键酶之一，G6PDH催化的反应伴随着还原力NADPH和戊糖的生成，参与氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成代谢，对细胞正常生长和代谢有重要影响。目前，对于G6PDH的研究主要集中在原核生物和动植物中，真菌中文献报道的菌种主要有黑曲霉、酿酒酵母。米曲霉是一类重要的工业微生物，关于米曲霉G6PDH基因（gsd）结构和功能的研究鲜有报道，仅在NCBI上公布了gsd假设蛋白的基因信息。
本实验组通过在大肠杆菌原核表达系统中，表达并纯化G6PDH，并对G6PDH进行酶学性质研究，为今后在戊糖磷酸途径上改造米曲霉代谢流，使得代谢通量更多地流向目标产物方向，为提高目标产物产量奠定基础。本实验的研究内容主要包括：
（1）实验室通过对米曲霉的培养获得菌株，提取其RNA，用逆转录PCR 法扩增米曲霉cDNA基因；
（2）利用融合PCR，扩增出cDNA-gsd，构建pET-32a-gsd原核表达载体[21]，并对其进行阳性克隆子鉴定及双酶切验证并测序；
（3）重组大肠杆菌进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平；
（4）利用组氨酸标签纯化G6PDH；
（5）对纯化后的G6PDH进行酶学性质研究。







第二章 实验材料和方法
2.1实验材料
2.1.1 主要仪器和设备
表2-1实验仪器
仪器 厂家
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2.1.2 菌种和质粒
Aspergillus oryzae CICC 2012：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，接种于葡萄糖-蛋白胨平板，¬-4℃保存，三个月传代一次；
E. coli DH5α和E. coli BL21 (DE3)：实验室保存，10%甘油、-70℃保存，为转化过程中的常见宿主菌；
pET-32a(+)多克隆载体：购自上海生工生物技术服务有限公司；
2.1.3 主要酶和生物试剂
Taq DNA polymerase、Rnase A、dNTP、Taq Plus DNA polymerase、EZ Spin Column DNA Gel E*traction KIT、EZ Column Plasmid Mini-Preps Kit：上海生工生物工程技术有限公司；
所用限制性内切酶、DNA marker：Takara（大连）有限公司；
RNAiso Plus：购自大连宝生物有限公司；
SDS-PAGE试剂盒：购自碧云天公司；
引物由上海生工合成，稀释成25 mM的工作液使用；
Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒：购自北京康为世纪生物公司。
2.1.4 试剂溶液和培养基配方
2.1.4.1 试剂配方
500 mmol/L EDTA（pH 8.0）：在80 mL水中加入18.61 g乙二胺四乙酸二钠，用NaOH（约2 g）调pH8.0，加水定容至100 mL。
1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）：80 mL水中加入12.11 g Tris，充分搅拌溶解，用HCl调节pH值至8.0，然后定容至100 mL。
TE缓冲液（pH 8.0）：取1 mL 500 mmol/L EDTA（pH 8.0），5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）加入烧杯中，用去离子水定容至500 mL即可，灭菌备用。
10% SDS（pH 7.2）：90 mL水中加入10 g电泳级十二烷基磺酸钠（SDS），加热至68℃助溶，用NaOH调pH 7.2，加水定容至100 mL。
10 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L K2HPO4（约60 mL）与 0.1 mol/L KH2PO4（约40 mL）混合至pH为7.0，然后定容至1 L，灭菌备用。
10 mg/mL胰Rnase：将RNase溶于10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/mL的溶液，100℃加热15 min，去除DNA酶活性，然后缓慢冷却至室温，分装保存于-20℃。
20 mg/mL IPTG：溶解0.6 g IPTG于去离子水中，定容至25 mL。用0.22 μm过滤膜过滤除菌，小份分装后，-20℃保存。
100 mg/mL氨苄青霉素：溶解2.5 g氨苄青霉素钠盐（Ampicillin）于去离子水中，定容至25 mL。用0.22 μm过滤膜过滤除菌，小份分装后，-20℃保存。
20 mg/ml *-Gal：溶解0.5 g *-Gal于二甲基酰胺（DMF）中，定容至25 mL，小份分装后，铝箔封裹，-20℃避光保存。
电泳缓冲液（50*TAE）：取24.2 gTris-碱，加入5.71 mL冰醋酸和10 mL 0.5 mol/L EDTA，用蒸馏水定容至100 mL，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳使用的是1*TAE缓冲液，使用时用蒸馏水稀释50倍。
75%乙醇：取75 mL无水乙醇，溶于0.1%DEPC水中配制成100 mL，不需高压除菌。按所需用量现配。
0.1 mol/L CaCl2：称取1.11 g的无水CaCl2溶解于去离子水中，定容至100 mL，灭菌备用。
0.1%DEPC水：在1000 mL双蒸水中加入DEPC原母液1 mL，然后搅拌至无油珠后静置过夜，121oC灭菌。
SDS-PAGE所用溶液：
SDS-PAGE中使用的电泳缓冲液是1*Tris-甘氨酸，其贮存液为5*Tris-甘氨酸。5*Tris-甘氨酸缓冲液成份：0.125 mol/L Tris，1.25 mol/L甘氨酸，0.5%（W/V）SDS。
10%分离胶（per 10 mL）：dd H2O 2.7 mL，30%丙稀酰胺3.3 mL，1.5 mol/L Tris （pH 8.8）3.8 mL，10%（W/V）SDS 0.1 mL，10%过硫酸胺0.1 mL，TEMED 4 µL。其中30%丙稀酰胺成份（per L）：丙稀酰胺290 g，N, N’-亚甲双丙稀酰胺10 g。
5％浓缩胶（per 3 mL）：dd H2O 2.1 mL，30%丙稀酰胺 0.5 mL，1.0 mol/L Tris （pH 6.8）0.38 mL，10%（W/V）SDS 0.03 mL，10%过硫酸胺0.03 mL，TEMED 3 µL。
考马斯亮蓝R-250染色液成份：0.1%（W/V）考马斯亮蓝R-250，40%（V/V）甲醇，10%（V/V）冰醋酸。
考马斯亮蓝染色脱色液成分：10%（V/V）冰醋酸，10%（V/V）甲醇。
2.1.4.2 葡萄糖-蛋白胨培养基
表2-2 葡萄糖-蛋白胨培养基配方(用于米曲霉培养)
试剂 含量
葡萄糖(Glucose) 2.0%
多聚蛋白胨(Polypepton) 1.0%
KH2PO4 0.5 %
NaNO3 0.1 %
MgSO4•7H2O 0.1 %
pH6.0；
固体培养基添加琼脂 1.5%
2.1.4.3 LB培养基
表2-3 LB培养基配方
试剂 含量
酵母提取物 0.5 %
NaCl 1.0%
胰蛋白胨 1.0 %
pH7.0；
固体培养基添加琼脂 1.8%
需要时使用前加入氨苄青霉素使终浓度为100 μg/mL，固体培养基添加1.5%琼脂，用于大肠杆菌培养。
2.1.4.4 SOC培养基
胰蛋白胨20.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KCl 2.5 mmol/L，MgCl2 10 mmol/L，葡萄糖20 mmol/L，pH7.0。
2.2实验方法
2.2.1 菌体的培养与收集
从4℃保藏的米曲霉菌体CICC2012斜面挑取米曲霉在葡萄糖-蛋白胨平板上划线活化，30℃培养箱中培养48 h，然后从活化好的平板上挑取适量菌丝到100 mL 2% 葡萄糖-蛋白胨液体培养基培养基的250 mL三角瓶中，在30℃恒温摇床中150 rpm培养3 d。无菌条件下，真空过滤收集菌体，用pH 7.0，10 mmol/L 磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，用玻棒与无菌滤纸尽量挤干菌体水分，使菌丝体呈“饼状”。收集于50 mL离心管中，直接使用或置 -20℃冰箱保存待用。
2.2.2 米曲霉总RNA的提取
（1）采用石英砂研磨法，称取0.5g新鲜菌体于无菌研钵中，加入适量石英砂研磨（0.1 g菌体-0.1 g石英砂），之后再加入过量的液氮将菌丝体覆盖，之后迅速研磨成粉末状，研磨时间控制在30 min，其间必须保证液氮覆盖菌丝体，研磨过程中要不断地添加液氮，（无明显的颗粒，如果没有研磨彻底，将会影响RNA的收率和质量）至裂解液研磨完之后迅速集合粉末于研钵底部中央；
（2） 每50~100 mg普通样品量迅速加入RNAiso Plus 1 mL抽提液将样品粉末状完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研椎继续研磨至裂解液完全呈透明水状；
（3）用DEPC处理过的大枪头和EP管，把混合液分装到已经灭菌的EP管中，室温静置5 min，加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5体积量），旋转混合仪混合10 s，室温静置5 min；12000 rpm、4 ℃，离心5 min；
（4）加入与上清液等体积的异丙醇，室温放置10 min，12000 rpm，4 ℃离心10 min，弃上清液；
（5）RNA沉淀的清洗。沉淀经1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）洗涤后，缓慢轻柔上下颠倒混匀5次，免触碰白色的沉淀；在操作台上将EP管内壁的水珠倒置于滤纸上，上下敲打EP管内的水分，充分干燥管内的乳白色沉淀物，室温干燥5 min（为了更好得控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）；
（6）RNA的溶解。室温干燥沉淀2~5 min（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解）。加入20~30 μL 0.1% DEPC水充分溶解白色沉淀物，必要时可以用移液枪轻轻吹打沉淀，待沉淀完全溶解后存于-80℃中，其余EP管放于-70℃冰箱中；
（7）0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。取5μL +1μL 6*Loading Buffer作为凝胶电泳分析。
2.2.3 米曲霉总cDNA合成
（1）模板RNA[22]：
将提取的Total RNA或poly(A)+RNA 取0.1~0.5 μg；(按RNA浓度公式计算)，加入1 μL引物Oligo(dT)18(0.5 μg/μL) ，用DEPC水补足至12 μL；
（2）将上述反应混合液装入200 μL EP管中，瞬时离心混合3~5 s；
70 ℃温浴 5 min，瞬时离心后冰浴30秒；
（3）在冰浴条件依次加入下列反应混合物：
5*反应混合液 4 μL；
RNase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL;
dNTP mi*(10 mmol/L) 2 μL;
瞬时离心；
（4）在37℃混合均匀5 min，之后加入：
MMULV反转录酶 1 μL；
最后的总体积 20 μL.
（5）瞬时离心后37℃ 1 h，最后于70℃终止反应，10 min后，反应液置于冰浴条件下。
2.2.4 融合PCR扩增cDNA-gsd
由于目的cDNA片段比较长，故采取两步PCR，即融合PCR的方法。分别扩增出具有重叠部分的两条片段，两条片段互为模板，最终拼接扩增出目的基因片段。融合PCR技术采用的是具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物。通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。
（1）引物设计
参照NCBI数据库中A.oryzae RIB40菌株的gsd（*P_001818354）基因序列，采用Primer 5.0软件，设计引物[23]，交由上海生工生物公司合成。
（2）引物信息
片段1上游引物1F：5′-CTACATTCCTTCCATCCCAC - 3′
片段1下游引物1R：5′-AACGTCACGAATGATACCAA - 3′
片段2上游引物2F：5′-GAACCGTCATCACATCGATAA - 3′
片段2下游引物2R：5′- ACTTTCGTTAGCCTCATAAGC - 3′
序列为扩增片段的特异性引物序列
P1：5′- CAGACGGAT ……（未完，全文共57986字，当前仅显示10430字，请阅读下面提示信息。收藏《毕业论文：米曲霉G6PDH基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质研究》）