论文开题：碱性蛋白酶生长菌株的筛选及鉴定及蛋白酶基因的克隆（2）

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：　　　化工学院　　　　　　　　　　专业班级：　　　08级生物技术

课题名称 碱性蛋白酶生长菌株的筛选及鉴定及蛋白酶基因的克隆（2）

1、本课题的的研究目的和意义：
蛋白酶是一类能水解蛋白质的酶，已广泛应用于食品、酿造、饲料、医药、纺织、日用化学等多个领域,在洗涤剂、皮革加工、银回收、医疗、食品加工、饲料和化学工业以及废物处理上都有重要作用。蛋白酶是目前世界上产销量最大的商业酶，其销售额占酶制剂总销售额的近60%。该酶广泛分布于动物、植物及微生物中。20世纪90年代以来，随着发酵技术的发展，微生物已日益成为工业酶制剂的主要来源，而海洋微生物由于其生存的特殊环境，分泌的各种酶类往往具有适应的pH和温度范围广、活性相对稳定等特性,已成为新型生物酶开发的主要资源。近年来，我国蛋白酶研究取得了较大进展，但还存在产酶微生物资源开发不足，蛋白酶种类单一等问题，因此研究的重点仍在于获得产蛋白酶活力
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离子对产酶（菌液的酶活）的影响。
5）纯化蛋白酶，并进行SDS-PAGE检测蛋白酶中杂质含量的高低。另外，每步纯化后，测定酶活，换算成比活来表示蛋白酶的纯化效果。
3、本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
1）分别测定6号菌株在不同盐浓度下的生长曲线、不同pH下的生长曲线、不同温度下的生长曲线，找出较适合生长的盐浓度、pH、温度。
2）根据较适合生长的盐浓度、pH、温度，设计3因素3水平的正交实验，确定最佳的发酵条件。
3）蛋白酶纯化及其性质研究，后者包括酶活的最适反应条件、影响因素及分子量。
成果以论文的形式展现。
4、拟解决的关键问题：
1）绘制6号菌株在不同盐浓度、不同pH、不同温度下的生长曲线，找出较适合生长的盐浓度、pH、温度，找出稳定期的起始时间和持续时间。
2）通过正交实验，找出最适合生长的盐浓度、pH、温度。
3）纯化粗酶提取液，使酶的比活增加。
5、研究思路、方法和步骤：
本研究所用菌株的来源：
中国第四次北极考察于2010年7月10日在B02站位（53.328499°N， 169.960434°E，水深1937 m，水温8℃，盐度32.9）采集到了含细菌的水样。2011届做毕业设计的本科生对该水样进行了分离筛选，得到了6号菌株等一些产蛋白酶的菌株。本研究所采用的菌株即6号菌株。
分离筛选过程：
1)将样品稀释成三个梯度（分别稀释10、100、1000倍），每梯度做三个平行。
2)取200μl各梯度样品，分别涂布于酪蛋白筛选固体培养基上，标记，用保鲜袋包好，于15℃培养箱培养。
结果10倍稀释的样品接种后产生了63株菌株，其中包括6号菌株。这些菌株能在酪蛋白平板上生长，说明可产蛋白酶。
3)用事先灭菌好的牙签挑取各菌株的单菌落接种于酪蛋白筛选平板相应位置上，如：标记6号的菌落分别接种于两种平板上标记为6的位置，依次完成所有菌落的接种。
这样可使各菌株生长的初始量一致，接下来比较蛋白水解圈大小即可比较各菌株产蛋白酶活性的相对高低。
4)置于15℃恒温培养箱中培养。
5)培养50 h后，用尺子测量酪蛋白筛选平板上68株菌的蛋白水解圈大小。
结果6号菌株是产生蛋白水解圈最大的3株菌株之一。因此，在2012年的毕业设计中，我对6号菌株的产酶活性和生长特性进行了进一步的研究。
本研究实验方案:
1）在Zobell 2216E固体平板上用平板划线法接种6号菌株。
2）待平板上长出一个个菌落后，挑取单菌落，接种到50mL Zobell 2216E液体培养基中。该培养基即种子培养基。
Zobell 2216E液体培养基的配方是：
每升培养基中，含
蛋白胨5g
酵母膏1g
NaCl 30g
水 1000mL
配Zobell 2216E固体培养基时，则再在每升中加入2%的琼脂（20g）。
3）待种子培养基中的细菌生长至一定浓度后，镜检，以确定没有染杂菌。一方面进行水制片，在油镜下观察细菌的形态是否均一；另一方面进行革兰氏染色，在油镜下观察染色结果是否与预期一致。根据11届毕业设计的结果，6号菌株应为革兰氏阴性菌。染色结果应为红色。
4）进行不同盐浓度下生长曲线的测定。
①　取500微升菌液（培养基体积的1%），分别接种到盐浓度为0%、1%、2%、3%、4%、5%的五个Zobell 2216E液体培养基中。每个培养基体积为50mL。在25度、200rpm下培养。
②　每隔8h取一次样，测OD600。一直测 ……（未完，全文共5384字，当前仅显示1891字，请阅读下面提示信息。收藏《论文开题：碱性蛋白酶生长菌株的筛选及鉴定及蛋白酶基因的克隆（2）》）