论文开题报告：半夏遗传结构SSR标记分析

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院　　　　　　　　　专业班级：09级园艺（观赏园艺）

课题名称 半夏遗传结构SSR标记分析

1、 本课题的的研究目的和意义：
半夏[Pinellia ternata (Thunb.) Breit.]是天南星科植物，药用部分为其干燥块茎，其味辛，性苦，有小毒，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效。其入药历史悠久，备受历代医家推崇，是一味常用传统中药。尽管在我国半夏野生资源分布十分广阔，但近年来，随着其市场需求量的持续增加，野生资源不断减少和半夏栽培技术远远滞后三者之间矛盾的日益加剧，我国半夏资源蕴藏量和产量都大幅下降。如何加强半夏资源的保护和满足市场需求，是当今中药工作者急需解决的问题。
本研究拟利用多态性丰富、稳定性好、特异性强的SSR标记对半夏的主要分布区湖北省、四川省、安徽省、云南省、贵州省等16个省共45个半夏_进行遗传结构的研究分析，以期为半夏遗传资源的保存及利用提供依据。

2、文献综述（国内外研究历史和现状）：
目前针对半夏的植株形态变异、有效成分、驯化栽培、炮制技术及真伪辨别等方面都有大量相关的研究报道，但是在对半夏遗传资源保存与利用具有极大指导意义的遗传结构及遗传多样性分析等方面的研究鲜有报道。已有的
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的遗传标记。现有的应用SSR对植物进行的研究如下：
孙琦等应用SSR标记进行了玉米遗传育种的研究；金梦阳等构建了甘蓝型油菜的SSR标记遗传图谱，得到了65个SSR标记；Tang等 利用SSR分子标记对14个花生属野生种和来自多个不同国家的24个花生栽培种进行亲缘关系研究，结果表明花生栽培品种可被划分为两个主要类群和4个亚类群。Zhan等对48个高粱、苏丹草及其近缘种进行SSR标记研究，发现该48个样品可被 聚为5个类群，且高粱和苏丹草关系十分密切,可归为同一品种。
经过本人大量的资料查找发现目前尚未有人利用SSR标记分析半夏的遗传结构，故本课题拟利用SSR标记对16个省共45个居群的半夏样品进行遗传结构的研究，以期对半夏资源的保护与利用提供参考依据。


3、本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：
3.1主要研究内容
半夏遗传结构的SSR标记分析：筛选合适、足量的引物对对来源16个省的45份半夏样本进行PCR扩增并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其遗传结构。
3.2成果形式
根据筛选的14对引物对142份半夏样本的SSR-PCR电泳图结合相应的软件得出PPL值、He值、Gst值、Nm值等，分析居群和物种水平遗传多样性、居群间遗传分化程度及聚类分析。


4、拟解决的关键问题：
①SSR-PCR体系与程序的优化；
②利用得到的数据兼顾表型性状分析半夏遗传结构。


5、研究思路、方法和步骤：
5.1 DNA提取
采用改良的CTAB法提取45份142个样本基因组DNA，利用琼脂糖电泳检测DNA的完整性，微量紫外分光光度计测DNA浓度（10ng/μl），记录相应的A260/280 值、260/230 值及DNA浓度， 最后调节工作浓度到10ng/μl，-20℃保存。
5.2 引物筛选
参照相关文献及半夏现有研究基础，从48对引物中筛选出以下14对多态性高、稳定性好的引物用于多态性分析。
序号 Code Tm Size 序号 Code Tm Size
① EF513098(S/A) 48.6 206 ⑧ EF488247(JB-AG) 50.9 154
② EF488249(JB-AG) 49.4 134 ⑨ EF513106(S/A) 50.9 214
③ EF488256(JB-AG) 49.4 99 ⑩ AY451853(S/A) 51.8 153
④ EF488272(JB-AC) 49.5 128 ⑪ AY243112(S/A) 52.3 206
⑤ EF488248(JB-AG) 50.0 137 ⑫ EF513100(S/A) 52.3 355
⑥ EF513108(S/A) 50.2 208 ⑬ EF513104(S/A) -- --
⑦ EF488281(JB-AC) 50.7 68 ⑭ EF513105(S/A) -- --


5.3 程序优化
94℃预变性4 min→94℃变性40 s→Tm退火40s→72℃延伸1 min→35 个循环→循环结束后72℃延伸5 min→4℃保存
如上所述，设置固定的程序，并根据不同引物设定不同退火温度与Grad级数，通过显带情况优化Tm值、循环次数等条件。

5.4 PCR扩增
反应体系共20μl，内含：10* PCR Buffer、0.25 mmol/L dNTPs（TakaraBiotec.）、1.5mmol/L MgCl2、0.2 5μmol/L 引物、1.0UTaqDNA聚合酶（Takara Biotec）、25 ng模板DNA。

5.5 电泳和银染
制胶（聚丙烯酰胺），上样（6*DNA Buffer，10*DNA Marker），电泳，银染（染色液，显影液，终止液），拍照（凝胶成像系统拍照）

5.6 数据分析
每个样品的扩增电泳谱带按有（1）和无（0）记录，构成原始数据矩阵。用POPGENE1.32、NTSYS-pc2.1和E*ell2003等软件统计分析，主要包括引物筛选机其多态性，遗传多样性分析和聚类分析等方面。


6、本课题的进度安排：
2013.02-2013.03：查阅相关文献
2013.03-2013.05：筛选引物、优化程序、体系，完成实验
2013.05-2013.06：数据分析及撰写论文
2013.06：答辩

7、参考文献：
[1] 胡新生. _遗传结构的理解[J]. 林业科学,2 ……（未完，全文共4873字，当前仅显示2461字，请阅读下面提示信息。收藏《论文开题报告：半夏遗传结构SSR标记分析》）