论文开题报告：米曲霉非同源重组蛋白ku70基因无痕敲除打靶载体的构建

大学本科毕业论文(设计)开题报告
学院：化工学院 　　　　　　　　　　　　　专业班级：08生物工程1班　　
课题名称 米曲霉非同源重组蛋白ku70基因无痕敲除打靶载体的构建

1、本课题的的研究目的和意义：
构建一种新型打靶载体，无痕敲除非同源组蛋白ku70基因，提高同源重组的概率，进而提高后续基因敲除的打靶效率。敲除*dh、ladA等基因,从而构建米曲霉代谢工程菌，可用于今后进行同源重组，为敲除木糖醇脱氢酶基因打下基础。


2、 文献综述（国内外研究情况及其发展）：
无痕基因敲除指既能敲除掉靶基因，却不引入标记基因的基因敲除方法。使用“拉图尔系统”敲除基因后不会留下任何外源片段，该系统可以在其他位点重复使用。只要有一个负选择标记基因，该系统就可以只依赖于同源重组而发挥作用，这个机理在生物体内是高度保守的[1]。该方法不需要特别的酶或序列参与，基本原理和操作步骤均很简单，具有相当高的效率，可广泛被应用等特点。“拉图尔系统”可以同时有效敲除长100kb，含有33个基因的一段染色体区域，且可以识别关键
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*dhA的载体pMD19－pyrG—*dhB，利用粘性末端连接法，将*dhA-A片段连接到pMD19－pyrG—*dhB，构成pMD19－pyrG―*dhAB片段。
(2) 完成了*dhA-A片段连接后，通过平末端连接方法将*dhA-C片段连接到pMD19－pyrG—*dhAB上，完成新型的载体的构建工作。
二、基因工程菌的筛选和验证。
4、拟解决的关键问题：
（1）如何提高同源重组和打靶效率，从而高效筛选出目的基因工程菌。
（2）米曲霉ladA基因敲除后，可能会再出现其别的拯救途径，如可能有其它旁路途径会出现。可考虑在此基础上继续敲除其它酶基因，阻断旁路代谢。
5、研究思路、方法和步骤：
一、思路：
无痕基因敲除指既能敲除掉靶基因，却不引入标记基因的基因敲除方法。因此我们采用了一种新的染色体修饰方法——“拉图尔系统”，使用“拉图尔系统”敲除基因后不会留下任何外源片段，该系统可以在其他位点重复使用。只要有一个负选择标记基因，该系统就可以只依赖于同源重组而发挥作用，这个机理在生物体内是高度保守的。
二、方法：
构建这样一个载体，它具有*dhA的上游结构（*dhA-A，*dhA-B）和下游结构（*dhA-C），也具有pyrG基因，导入米曲霉体内后通过两次同源重组敲除*dhA：第一次同源重组可以使这个载体整合到*dhA的上游，所得阳性重组子是含有pyrG，我们可以用不含尿嘧啶核苷的培养基把它筛选出来。由于这样的重组子在pyrG的上游具有*dhA下游结构(*dhA-C)，使得DNA分子内发生第二次同源重组成为可能，一旦分子内第二次重组成功，则pyrG和*dhA将会一起被剔除掉，由于不含pyrG的菌株可以避免5-氟乳清酸这一代谢拮抗剂进入代谢嘧啶碱的合成途径，所以在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培养基上，可以筛选出不含有pyrG的重组菌株[7]，同时也就是*dhA的剔除株。选用pMD19-T质粒来构建这一载体。pMD19-T质粒是pUC19质粒的一种线性改造质粒，在其3端具有多聚T尾，通过TA和酶切连接，我们可以依次连接上pryG、*dhA-B、*dhA-A和*dhA-C片段。
三、步骤：
首先以米曲霉KBN616基因组为模板，分别扩增出ku70基因上游片段K-A、K-B，ku70基因下游片段K-C及标记pyrG基因。而后分别以这四个片段为模板，设计多对引物，分别扩增出片段1、片段2、片段3和片段4。其中片段1上带有酶切位点EcoRI/HindIII，片段2上带有酶切位点HindIII/KpnI，通过三段酶切连接，可将片段1和片段2连接到质粒pUC57上，得到亚克隆载体pUC57-A。同理，通过片段3和片段4上的酶切位点KpnI /BamHI和BamHI/ SalI，可将片段3和片段4连接到质粒pUC57上，得到亚克隆载体pUC57-B。而后分别提质粒、PCR扩增亚克隆载体pUC57-A和pUC57-B，可分别获得片段A和片段B。利用片段A上的酶切位点EcoRI/KpnI和片段B上的酶切位点KpnI/ SalI，再次三段酶切连接，可将片段A和片段B连接到质粒pUC57上，最终获得打靶载体pUC57-pyrG-ku70ABC。该法充分利用了K-A片段及pyrG片段上已有的酶切位点，通过融合PCR的方式构建中间片段，而后通过三段酶切连接的方式构建亚克隆载体和打靶载体，避免了反复的转化和繁琐的平端连接步骤，快速高效的完成了打靶载体的构建。
6、本课题的进度安排：
2011.09-2011.10 查阅相关的文献，制定具体的实验方案；
2011.10-2011.11 构建新型打靶载体pMD19-pyrG-ladA-ABC；
2011.11-2011.12 米曲霉CaCl2/PEG原生质体转化；基因工程菌的筛选和验证;
2011.12-2012.01 解决一些后续问题 ……（未完，全文共4136字，当前仅显示2089字，请阅读下面提示信息。收藏《论文开题报告：米曲霉非同源重组蛋白ku70基因无痕敲除打靶载体的构建》）