论文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固体发酵培养基的响应面优化

论文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固体发酵培养基的响应面优化
曾庆才1,2,肖荣凤2,刘波2*,胡桂萍2

福州大学生物科学与工程学院,福建 福州 350108;2.

福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建 福州 350003)

摘要:

利用响应面方法研究生防菌哈茨木霉FJAT-9040固体发酵的培养基,探索疏松值、无机碳源、无机氮源对产孢量的影响.单因子实验结果表明:哈茨木霉固体发酵培养基的主成份、疏松值、最适无机碳源、最适无机氮源分别为微生物养猪垫料:麸皮=9:1、麦粒40%、蔗糖3%、硫酸铵2%.响应面分析结果表明:麦粒、蔗糖、硫酸铵对哈茨木霉产孢量有显著相关性,通过求解回归方程可得:当麦粒含量36.72%,蔗糖含量3.08%,硫酸铵含量1.74%时,孢子产量可达2.80*1010个/g.

关键词:哈茨木霉 固体发酵 培养基 产孢量 响应面分析法

中图分类号 Optimization of solid-state fermentation culture medium for the biocontrol strain of Trichoderma harzianum FJAT-9040 by response surface methodology. Abstract: Response surface methodology was used to optimize solid-state fermentation culture medium of Trichoderma harzianum FJAT-9
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刘爱荣等,2010;管怀骥等,2011;姚 彬等,2009);对黄瓜、花生和茄子等多种作物促进生长的作用(杨春林等,2008;王献慧等,2012;胡 洁等,2012);诱导水稻等抗病性(Nzojiyobiri jean Berchmans等,2003)等等. 木霉菌要有良好的防治效果,生产发酵是关键.目前,生产上木霉的应用多有孢子菌剂,虽然不少学者对其代谢产物在生防作用上进行了研究(李 杰等,2011;王红梅等,2010;郭培磊等,2009),但是由于代谢产物的复杂性,增加样品处理的难度,使实验操作工作量大,大大增加了生产成本,最终未能很好地在工业上应用.通过发酵方式(液体发酵或固体发酵)可以获得更多的孢子量.由于液体发酵所需设备相对复杂,发酵产物浓度不高,生产成本高(葛 龙等,2010),而固体发酵具有培养基来源丰富,价格低廉,操作简单,孢子质量好等一系列优势被公认为是获得真菌孢子的最好方法之一(敖新宇等,2012).固体发酵的培养基可以是稻草、麸皮、秸杆等农业副产物,近年来兴起地微生物发酵床养猪技术带来了新的农业副产物——微生物养猪垫料.它是通过微生物将谷壳,锯末等发酵床原料及猪的粪尿的混合物中的有机物质进行分解发酵,使垫料中含有丰富的养料(蓝江林等,2012).若将其作为固体发酵的培养基,能为菌株提供丰富的营养物质,不但可以获得大量的生防因子,还可以处理一些农业副产物,提高资源的利用价值,实现可持续发展.目前,仍较少见以微生物养猪垫料作为微生物固体发酵主要基质的报道. 微生物发酵培养基的优化方法很多,如单因素实验法、正交设计试验法、响应面优化设计法等(肖怀秋等,2010),其中响应面优化设计以试验次数少,周期短等优势受到广泛应用(郝学财等,2006).响应面分析法是通过合理的实验设计,获得一定数据来拟合一个响应面,从而摸拟出真实的极限条件下的曲面,并进行可靠性地分析(张秀霞等,2012).响应面分析法可以对一次项、二次项及其交互项对响应值的影响进行分析,通过之间的关系在响应面上获得最佳点,在试验设计与试验分析上具有更多优势(张秀霞等,2012). 本研究以微生物养猪垫料作为哈茨木霉FJAT-9040固体发酵的主要培养基,通过单因素实验与响应面法进行哈茨木霉FJAT-9040固体发酵培养基的优化,筛选出哈茨木霉FJAT-9040最适产孢的固体发酵培养基配方,旨在进一步提高哈茨木霉FJAT-9040的产孢量和农业副产物的利用率,为含哈茨木霉的生物菌肥和制剂的工业化生产提供理论指导.

1 材料与方法

1.1 供试菌种 哈茨木霉FJAT-9040,本研究所微生物菌种保存中心保存.

1.2 培养基 PDA培养基 马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,蒸馏水 1 L,pH 自然. 固体发酵培养基 微生物发酵一年垫料、麸皮、麦粒、碳源、氮源、自来水等按适合比例混合

1.3 方法

1.3..1 固体发酵培养基主要成份垫料与麸皮配比的筛选 主要成份垫料与麸皮按体积比为10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,0:10等配制7种培养基,每处理重复3次.组培瓶中装50 ml培养基,初始含水量40%,封口膜封口,121 ℃,灭菌30 min,冷却后,接入哈茨木霉FJAT-9040孢子悬浮液(1.0*107个/ ml),初设接种量为5%,28 ℃恒温培养5 d.待发酵结束后,取5 g固体发酵物于45 ml无菌水中,用磁力搅拌器搅拌均匀,并将其稀释至适当倍数后,吸取100 ul,于PDA平板上涂布均匀,28 ℃恒温培养2 d,记录平板上的孢子数.孢子数/g=同一稀释度平均孢子数*10*稀释倍数/5.筛选出最佳的主要成份配方.

1.3..2 培养基中麦粒含量对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响 往1.3.1中筛选出的培养基中添加浸泡过夜的麦粒,按体积比为10%、20%、30%、40%、50%进行添加,每处理重复3次.以下处理方法同1.3.1.筛选出最佳的疏松值含量.

1.3..3培养基中碳源对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响 往1.3.1中筛选出的培养基中分别添加葡萄糖、蔗糖、乳糖,每处理重复3次.以下处理方法同1.3.1.筛选出最佳的无机碳源及最适浓度.

1.3..4培养基中氮源对哈茨木霉FJAT-9040产孢量的影响 往1.3.1中筛选出的培养基中添加硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠,每处理重复3次.以下处理方法同1.3.1.筛选出最佳的无机氮源及最适浓度.

1.3..5响应面优化设计 在单因素筛选实验的基础上,根据Bo*-Benhnken设计原理,采用软件Design e*pert8.0进行三因素三水平的响应面的分析实验,以孢子数为响应量,确定各因素对哈茨木霉FJAT-9040产孢量影响的显著性和各组分的最佳组合.根据Bo*-Benhnken设计原理,响应因子Y为哈茨木霉FJAT-9040的产孢量,麦粒(*1)、蔗糖(*2)和硫酸铵(*3)为三因素,因素三水平分为:-1、0和1、试验设计具体见表1. 表1培养基Bo*-Behnken因素水平表 Table1 The table of Bo*-Behnken factors 变量 代码 编码水平 未编码 编码 -1 0 1 麦粒 *1 A 30% 40% 50% 蔗糖 *2 B 1.0 g 1.5 g 2.0 g 硫酸铵 *3 C 0.5 g 1.0 g 1.5g 1.4 数据处理 数据统计分析通过E*CEL数据处理,响应面分析法利用Design-e*pert 8.0软件采用Bo*-Benhnken设计方法,对培养基及其培养条件进行三因素三水平优化. 2 结果与分析 2.1 固 ……（未完，全文共12960字，当前仅显示3083字，请阅读下面提示信息。收藏《论文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固体发酵培养基的响应面优化》）